通路克隆入门载体pEN_L4_PrbcS_T_gfp_L3_的构建和其应用.pdfVIP

第 卷第 期 生命科学研究 15 6 Vol．15 No．6 年 月 2011 12 Life Science Research Dec. 2011 通路克隆入门载体pEN-L4*-PrbcS-*T-gfp -L3* 的构建及其应用 * 肖素勤 孙 振 王莎莎 梁 锋 李 莉 年洪娟 李昆志 陈丽梅 , , , , , , , ( 昆明理工大学生物工程技术研究中心, 中国云南昆明650500) 摘 要 为了利用通路克隆 技术构建一个含有两个目的基因表达盒的植物表达载体 并把目的基因 : (Gateway) , 编码的蛋白质定位到转基因植物的叶绿体中 通过定点突变技术 在含有 和 重组位点的 , , attL4 attL3 Gateway 入门载体 中产生 和 的酶切位点 然后在这两个酶切位点之间插入一个含有 pEN-L4-2-L3 Hind Ⅲ Xho Ⅰ , 1, 5- 二磷酸核酮糖羧化酶小亚基的光诱导型启动子 及其叶绿体基质定位序列 和绿色荧光蛋白 报告 (PrbcS) (*T) (GFP) 基因 的 片段 获得 入门载体 用该载体和另一个含有 和 重组 (gfp) DNA , pEN-L4*-PrbcS-*T-gfp-L3* . attL1 attL2 位点的入门载体(pENTR*-PrbcS-*T-gus) 与Gateway 的目的载体pK7 m34GW2-8 m21GW3 进行 LR 重组反应可 以构建一个能串联 和 两个报告基因表达盒的植物表达载体 gfp gus pKm-35S-PrbcS-*T-gfp-PROLD-PrbcS-*T- 所构建的植物表达载体转化烟草后 和 基因能插入到转基因烟草的基因组中并正常表达 所表达 gus, , gfp gus , 的 蛋白可正确定位到转基因植物的叶绿体中 而