核酸分离与纯化.pptxVIP

核酸分离及纯化;核酸在体内的分部情况： DNA 真核生物：细胞核：95％ 细胞器：5％ RNA 细胞质：75％ 细胞核：10％ 细胞器：15％ rRNA：80-85％，tRNA和mRNA：10-15%;概述： 核酸包括DNA和RNA, 及蛋白质结合的状态存在 结构形式多样： 真核生物：染色体DNA：双链线性分子 原核生物基因组DNA、质粒、真核细胞器：双链环状 病毒DNA：双链/单链环状、双链/单链线状 RNA：多为单链线性分子;核酸分离纯化的原则： 保持其一级结构的完整性 完整的一级结构是研究核酸功能的最基本要求 遗传信息保存在一级结构中 一级结构决定其高级结构 一级结构决定及其它生物大分子结合的方式 排除其它分子的污染;纯化核酸样品应达到的三点要求： 无有机溶剂和过高浓度金属离子的存在 二者对酶的活性有抑制作用 其它生物大分子的浓度应该尽量低 蛋白质、多糖、脂类：影响后续分子生物学实验 去除其它核酸的污染 尽量减少DNA中RNA污染，反之亦然 排除异种生物的DNA/RNA污染;实验中应注意的几点问题： 减少化学因素对核酸的降解 避免过酸或过碱，操作时PH值多在4-10之间 减少物理因素对核酸分子结构的破坏 主要是机械剪切力和高温 防止核酸的生物降解 尤其是RNA抽提过程中防止RNase对RNA的降解 尽量减少操作步骤，缩短提取过程 减少各种负面因素对核酸的降解;;DNA分离 基因组DNA分离 质粒DNA分离 凝胶DNA回收 PCR产物纯化 ;一、基因组DNA抽提;G-spin Genomic DNA Kit ;;EzWay Genomic DNA Kit, Multi;基因组DNA抽提常见问题分析(一);Q3、A260/A280 比值较低 用水作为洗脱液时，比值偏低 ;质粒特性介绍：;小量抽提 GeneJET Plasmid Miniprep Kit（有现货） 同下面产品类似，价格相对要贵 DNA-spin Plasmid DNA Extraction Kit（价格更有优势） 所有后续分子生物学操作，包括转染 EzWay Plasmid DNA Kit, Mini（价格太贵） 测序、体外转录及翻译、酶切、转化、文库筛选 中量抽提 DNA-midi Plasmid DNA Extraction Kit 测序、转染、体外转录与翻译;分离示意图;质粒DNA抽提常见问题分析(一);质粒DNA抽提常见问题分析(二);三、凝胶DNA回收;分离示意图;凝胶DNA回收常见问题分析;四、PCR产物纯化;分离示意图;PCR产物纯化常见问题分析;Total RNA： Messenger RNA (mRNA) Ribosomal RNA (rRNA) Transfer RNA (tRNA);非过柱方法 ——最经典的RNA抽提方法 TRI Reagent（TRIzol）（重点推荐，有现货） 过柱方法： easy-Spin Total RNA Extraction Kit 硅胶吸附原理，30分钟，纯度高，无DNA残留，动植物细胞/组织 RNA-spin Total RNA Extraction Kit 硅胶吸附原理，细胞、组织、细菌，30分钟，效率95％ Viral Gene-spin Viral DNA/RNA Extraction Kit 硅胶吸附原理，，同时分离病毒的DNA/RNA。20分钟 ;MRC公司简介： 美国公司，全名Molecular Research Center(MRC)，专门致力于开发各类DNA、RNA抽提试剂。 TRI reagent：专利产品，唯一商业化的从样本中同时抽提RNA、DNA和蛋白质的生物试剂。 TRIzol是MRC公司的注册商标。 相关产品： TRI reagent：组织（动物、植物）、单层培养细胞 TRI reagent BD：全血、血清 TRI reagent LS：细胞悬浮液、其它液体标本;RNA抽提操作流程： 组织匀浆（50