第3章：工业微生物育种诱变剂.docxVIP

第一章工业微生物育种诱变剂1物理诱变剂的总类：物理辐射分为电离辐射和非电离辐射。包括紫外线、X射线、r射线。快中子。微波，超声波、电磁波、激光射线和宇宙线等。（X射线、r射线属于电离辐射，紫外线属于非电离辐射）2物理诱变剂对微生物的影响实质：由高能辐射导致生物系统损伤，继而发生遗传变异的一系列复杂的连锁反应过程。3辐射作用的时相阶段：物理阶段——直接作用DNA或作用于水物理化学阶段——激发和电离DNA分子或激发电离水分子化学阶段——产生生物自由基生物学阶段——分子发生变化，变异或死亡4细菌中紫外线对DNA的影响：促使G:CA:T的转换； DNA链断裂，单链或双链；嘧啶或嘌呤被氧化脱去氨基；碱基分子结构中碳与碳之间的链断裂形成开环现象；辐射击中单个核苷酸后，使碱基或磷酸酯游离出来；交联作用5辐射引起的生物学效应的影响因素：微生物的遗传背景；微生物的生理状态；可见光；细胞水分；温度；空气或氧气。6紫外线的诱变机理及原因？机理：(1)DNA与蛋白质交联(2)胞嘧啶与尿嘧啶之间的水合作用(3)DNA链断裂，形成嘧啶二聚体原因：形成嘧啶二聚体7DNA损伤修复中光修复与暗修复的主要机理？ 光修复：嘧啶二聚体被一种光激活酶结合形成复合物，这种复合物在可见光下由于光激活酶获得光能而发生解离，从而使二聚体重新分解成单体。暗修复：嘧啶二聚体的5’端限制性内切酶和外切酶的作用下，造成单链断裂，接着在外切核酸酶的作用下，切除嘧啶二聚体。然后再DNA聚合酶Ⅰ、Ⅲ的作用下，并以另一条完整的单链做模板合成正确的碱基对序列，最后由连接酶完成双链结构。8紫外线有效波长（诱变）范围是：200~300nm9紫外线的剂量以什么计算？ 绝对剂量：erg/mm2；相对剂量：照射时间、杀菌率表示10紫外线诱变的步骤方法（以及应用，包括如何计数、致死率的计算）步骤： （1）出发菌株的选择将细菌斜面培养至对数期，霉菌或放线菌培养至孢子刚成熟（2）前培养培养基中可添加咖啡碱或异烟肼等抗修复物质。将菌体培养至最佳状态（对数期）。（3）制备菌悬液离心去除培养基，用生理盐水制备菌悬液，要求菌体浓度108，107， 106 mL-1等（4）紫外线照射 紫外灯预热20min；避免光修复。（5）后培养将照射完毕的菌悬液加入到适合于正突变体增殖的培养基中，在适宜温度下培养1.5-2h。（6）稀释涂皿 后培养结束后，从中取一定量培养物，经不同稀释，涂皿，并且以未经紫外线照射过的菌悬液做对照皿，培养后，挑取菌落，以待筛选。11化学诱变剂的概念：一类能够对DNA起作用、引起遗传变异的化学物质。12以5-BU为例，详述碱基类似物的诱变机理：（见书43页）答：诱变作用是取代核酸分子中碱基的位置，再通过DNA的复制，引起突变，因此，也叫掺入诱变剂。争产掺入错误复制碱基对———— BU掺入————_错配——————突变AT AT,ABU（酮式） AT,GBU（烯醇式） GC2)错误掺入正常复制碱基对————BU掺入————错配——————突变GC GC,GBU（烯醇式） GC,ABU(酮式) AT13烷化剂的诱变机制：答：烷化剂主要是通过烷化基团使DNA分子上的碱基及磷酸部分烷化，DNA复制时导致碱基配对错误而引起突变。烷化剂也能造成磷酸和核糖之间的共价键断裂，而造成突变。 14烷化剂的使用为什么要溶解在缓冲液中？答：溶液烷化剂的性质比较活泼，不太稳定，在水溶液中容易发生分解。它们大部分半衰期很短，其长短与温度、溶液pH关系很大。因此，化学诱变剂要现用现配还要避光。配制烷化剂时，要采用合适的出缓冲液。15常用烷化剂亚硝基胍（NTG）的处理方法：答：取新鲜斜面，用一定pH值的磷酸缓冲液或Tri缓冲液洗制成菌悬液。②NTG母液：配制需加助溶剂甲酰胺或丙酮少许，然后加缓冲液，其比例为缓冲液：NTG丙酮溶液=9:1，一般配置母液浓度为1mg/ml；使用时取母液0.2ml，加菌悬液1.8ml，NTG终浓度为100ug/ ml。③将以上菌悬液和NTG溶液盛于一试管内，把该菌放在生长适宜的温度下保温处理若干时间，一般细菌20-60min,孢子90-120 min④终止反应：在低温下进行离心洗涤，除去药液，加无菌水使沉淀悬浮并作成一定稀释度，分离于平皿。16以亚硝酸为例详述脱氨剂的作用机制：答：脱去碱基中的氨基变成酮基，引起转换而发生变异。AH， CU, GX, A：TG:C和 G:CA:T亚硝酸的诱变也可以发生回复突变。要硝酸除了脱氨基作用外，还可引起DNA交联作用，阻碍双链分开，影响DNA复制，从而导致突变。NaNO2+H+HNO2+Na+；2HNO2N2O3+N2O；N2O3NO+NO217羟化剂的诱变机制：答：当羟胺浓度为0.1～1.0mol／L p