霍乱弧菌Fosmid文库的构建、分析及应用（Construction, analysis and application of Vibrio cholerae Fosmid Library）.pdfVIP

谨以此论文献给给予我悉心指导的梁成珠研究员及 关心爱护我的亲人、朋友们！ 倪鑫 霍乱弧菌Fosmid 文库的构建、分析及应用 摘 要 霍乱，又称为亚细亚霍乱或传染性霍乱，是主要由O1 和O139 血清型霍乱 弧菌引起的一种烈性、猝发性的细菌性传染病，其危害仅次于鼠疫。随着环境和 人类生活方式的转变，霍乱弧菌已经出现了细菌毒力、菌落特征等方面的变异。 而随着分子生物学的发展，霍乱弧菌的检测方法也从传统的表型特征鉴定向遗传 特征基因鉴定转变。为了能够准确、快速、安全的检测霍乱弧菌，特别是产毒型 霍乱弧菌，本研究首先从分子生物学水平构建了包含霍乱弧菌全套基因的 Fosmid 文库，使霍乱弧菌遗传信息转移到易于培养的大肠杆菌中去；通过基因 水平的筛选，获得了霍乱弧菌常见的5 种高度保守特征基因。为了满足普通实验 室对霍乱弧菌阳性对照的需求，本论文对筛选出的 5 种霍乱弧菌保守基因的 Fosmid 质粒进行稳定性研究，制备出可作为阳性对照的霍乱弧菌 Fosmid 质粒 标准样品并以制备的tcpA-Fosmid 质粒标准样品为模板，通过对传统切刻内切恒 温扩增技术（NEMA ）的优化和改良，建立一种新型的O1 和O139 型霍乱弧菌 的切刻内切恒温扩增（NEMA ）快速检测方法。 1. 选取O1 和O139 型霍乱弧菌为研究对象，利用低熔点琼脂糖包埋法获得 高质量的O1 和O139 型霍乱弧菌基因组DNA ，用随机剪切法将基因组进行片段 化处理，脉冲电泳分离片段化DNA 并切胶回收33kb~48kb 之间的DNA 片段， 然后对DNA 片段进行末端平滑化和磷酸化处理，与pCC1FOS 载体连接，经包 装、转染、筛选阳性克隆构建霍乱弧菌Fosmid 文库。所建的Fosmid 文库库容量 为355Mb，平均插入片段为35kb ，共保存9600 个克隆，空载率小于2% 。经稳 定性实验证明所建文库克隆能够稳定繁殖。为下一步O1 和O139 型霍乱弧菌目 的基因的筛选、文库的应用研究奠定了基础。 2. 利用实时荧光PCR 从霍乱弧菌Fosmid 文库中筛选出含tcpA、ctxAB 、hlyA 、 rfb-O1 和rfb-O139 保守性特征基因的阳性克隆菌株，通过提取Fosmid 质粒并对 其稳定性进行研究，最终研制出具有较好稳定性的含有霍乱弧菌tcpA 基因、hlyA 基因、rfb-O1 基因、rfb-O139 基因和ctxAB 基因的Fosmid 质粒标准样品。该质 粒标准品的研制基本满足了实验室对霍乱弧菌阳性对照的需求。 I 3. 选取已制备的 tcpA-Fosmd 质粒标准样品为阳性模板，对传统NEMA 技 术进行了优化和改良。在参考传统的NEMA 反应体系基础上，对影响扩增效率 的关键因素—如温度、缓冲环境、镁离子及DMSO 浓度分别进行了优化。经试 验确定，以磷酸钾缓冲液作为缓冲环境，反应温度59℃、镁离子和DMSO 终浓 度分别为5 mmol/L、5 %时扩增效率最高。为了弥补传统NEMA 一步法容易形 成引物二聚体的缺陷，本论文将传统的一步法体系改良为两步法，即在正式扩增 前，引入了预反应步骤；用优化和改良的NEMA 扩增体系对O1 和O139 型霍乱 弧菌进行特异性和灵敏度研究，结果表明，所建立的NEMA 技术对O1 和O139 型霍乱弧菌有很好的特异性和较好的灵敏度，随着该技术的进一步成熟，可以用 于试剂盒等诊断产品的研发。 关键词：霍乱弧菌；Fosmid 文库；NEMA 技术 II Construction、analysis and application of the Fosmid Library for Vibrio cholera Abstract Cholera, also known