08生科第4章 蛋白质共价结构(生科).ppt

授课对象： 2008生物科学本科 授课时数： 3学时 教学目的要求： 掌握：蛋白质元素组成和平均含氮量；蛋白质结构的组织层次；蛋白质一级结构的定义及维系的化学键；胰岛素一级结构特点；肽键的概念、性质、肽及多肽链。 熟悉：蛋白质分类、蛋白质功能的多样性。 了解：谷胱甘肽的结构和功能；测定蛋白质一级结构的策略。 自学：蛋白质序列分析中的重要方法和技术。 Protein —— 来自希腊字母，意思是“头等 重要的，原始的” 蛋白质 —— 来源于对蛋清（清蛋白）的研究 （一）蛋白质的化学组成和分类 1. 蛋白质的元素组成 2. 蛋白质的分类 二、肽 （三）天然存在的活性肽 谷胱甘肽(glutathione, GSH) P165 （二）肽的物理和化学性质 肽的酸碱性质主要取决于N端游离的α-氨基、C端游离的α-羧基、侧链R上可解离基团。 肽的等电点计算：兼性离子两侧pKa的平均值 肽的化学反应： 与AA相似：α-氨基的反应、α-羧基的反应、侧链R基的反应、茚三酮反应 与AA不同：双缩脲反应 γ-羧基 P168 巯基 GSH过氧化物酶 H2O2 2GSH 2H2O GSSG GSH还原酶 NADPH+H+ NADP+ GSH的巯基具有还原性，可作为体内重要的还原性剂，保护体内蛋白质或酶分子中巯基免遭氧化，使蛋白或酶处在活性状态。 primary structure of protein定义 蛋白质一级结构指多肽链中氨基酸残基的排列顺序。 三、蛋白质一级结构的测定 主要的化学键：肽键 P168 即氨基酸的线性序列。在基因编码的蛋白质中，这种序列是由mRNA中的核苷酸序列决定的。 二硫键 胰岛素的一级结构 各种蛋白质的根本差异在于一级结构的不同 一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础，但不是唯一因素。 1955年英国剑桥大学Sanger报告了胰岛素的一级结构。 a、样品必须是均一的，纯度应在97%以上； b、知道蛋白质的分子质量，其误差允许在10%左右； c.知道蛋白质由几个亚基组成； d.测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。 e.测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。 1.测定蛋白质一级结构的要求： （一）蛋白质一级结构的测定 P168 2 . 测定一级结构的基本原理和方法 基本策略： 氨基酸顺序直测法＋片段重叠法 基本步骤： (1)测定末端氨基酸数目：确定蛋白质分子肽链构成数 N末端分析-苯异硫氰酸酯(PITC)法 C末端分析-羧肽酶法 蛋白质与末端基摩尔数定量 (2)拆分蛋白质分子的多肽链：亚基解聚 链间二硫键 ⑶断开多肽链内二硫键并分离出每条肽链 过量巯基乙醇、 8mol/L尿素或8mol/L盐酸胍。 ⑷分析每条多肽链的氨基酸组成：分离 纯化 完全水解 测定组成 AA分析仪测定 计算氨基酸的组成比及各残基数 (6)至少用两种方法裂解多肽链成较小的片段： 酶裂解 CNBr 断裂点不同 得到几套重叠片断 分离纯化 测片断组成末端分析 (7)测定各肽段的氨基酸序列： Edman降解法 (8)片段重叠法重建完整多肽链一级结构； (9)确定半胱氨酸残基间形成二硫键交联桥的位置 胃蛋白酶水解 Brown或Hartlay对角线电泳第一相 甲酸蒸汽处理 旋转90o 相同条件第二相电泳 显色定位 偏离对角线片断分析 序列比较推断位置 (5)鉴定多肽链N－末端、C－末端氨基酸残基 N末端分析-苯异硫氰酸酯(PITC)法 C末端分析-羧肽酶法 将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序 将肽段分离并测出顺序 专一性裂解 末端氨基酸测定 二硫键拆开 纯蛋白质 蛋白质顺序测定基本方法路线 P179 肽段在多肽链中次序的决定 通常用两种或两种以上的不同方法断裂多肽样品，产生两套或几套肽段，不同的断裂方法使多肽链肽键断裂的位置不同，切口彼此错位，因而两套肽段可以跨过切口重叠，这种跨过切口重叠的肽段称重叠肽，通过该法可确定肽段在原多肽链中的正确位置，拼凑出整个多肽链的AA序列。 * 授课教师 沈蓉 生物化学与分子生物学教研室 蛋白质的共价结构 第 4 章 Covalent Structure of Protein P157 ???????????????????? 分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；