第九课：维真生物-如何阅读基因载体图谱.docVIP

如何阅读基因载体图谱 基因载体是基因工程的核心，也是基因治疗中强有力的生物工具，我们先来认识和阅读载体图谱吧。 一、载体分类及载体组成元件 载体分类 1、按属性分类：病毒载体和非病毒载体 病毒载体是一种常见的分子生物学工具，可将遗传物质带入细胞，原理是利用病毒具有传送其基因组进入目的细胞，进行感染的分子机制。可发生于完整活体或是细胞培养中。可应用于基础研究、基因疗法或疫苗。用于基因治疗和疫苗的病毒载体应具备以下基本条件： （1）携带外源基因并能包装成病毒颗粒； （2）介导外源基因的转移和表达； （3）对人体不致病； （4）在环境中不会引起增殖和传播。 ???非病毒载体一般是指质粒DNA。 2、按进入受体细胞的类型分类：原核载体、真核载体、穿梭载体（含原核和真核2个复制子，能在原核和真核细胞中复制，并可以在真核细胞中有效表达）。 3、按功能分类：克隆载体、表达载体 克隆载体：具有克隆载体的基本元件（Ori，Ampr，MCS等），可以携带DNA片段或外源基因进入受体细胞并克隆和大量扩增DNA片段（外源基因）的载体。 ???表达载体：克隆载体中加入一些与表达调控（具有转录/翻译所必需的DNA顺序）有关的元件即成为表达载体。 载体组成元件 1、复制起始位点Ori：即控制复制起始的位点。Ori的箭头指复制方向，其他元件标注的箭头多指转录方向（正向）。 2、抗生素抗性基因：可以便于加以检测，如Amp+?，Kan+ （1）Ampr：水解β-内酰胺环，解除氨苄的毒性。 （2）tetr?：可以阻止四环素进入细胞。 （3）camr：生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 （4）neor（kanr）：氨基糖苷磷酸转移酶，使G418（卡那霉素衍生物）失活。 （5）hygr：使潮霉素β失活。 3、多克隆位点：MCS克隆携带外源基因片段，它具有多个限制酶的单一切点，便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。还要再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10kb的外源DNA片段。一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。 4、P/E：启动子/增强子 5、Terms：终止信号 6、加poly（A）信号：可以起到稳定mRNA作用 ? 示例阅读载体： pENTER载体 1）human ORF + pENTER载体? 2）?CMV启动子，T7启动子? 3）?ORF的C端融合了Flag和His tag 4)??多克隆位点，常用AsisI?和?MluI(人源基因上不常见的)? 4）?SV40 poly（A）加尾信号 5）?SV40启动子启动的puro标记? 6）?2个腺病毒ITR序列和2个与腺病毒Ad5同源的序列，可用于将ORF序列同源重组到腺病毒载体，直接用于腺病毒的生产。 慢病毒载体 1）EF1a启动目的基因（可添加小标签FLAG或HIS等小标签）? 2）CMV启动GFP，非融合抗性筛选标记Puro（便于做细胞株的稳筛） 3）WPRE（来自土拨鼠肝炎病毒的转录后调节元件），放置在目的基因的上游，能加强转基因的表达 4)? cPPT（来自HIV-1整合酶基因），增加慢病毒在宿主基因组的拷贝数，提高病毒滴度 5）第三代慢病毒载体，载体中还包含HIV-1基因组中的顺式调节元件(ψ?包装?信号和LTR?长末端重复序列，其中3’LTR增强子功能缺失，5’LTR中U3区替代为CMV，更加安全的病毒载体) ? 腺相关病毒载体 AAV表达载体包括了中两个ITR + CMV（可替换其他组织特异性启动子，见改造载体部分）+?globin intron?内含子序列?+?目的基因?+ poly A序列 二、选择和准备载体 选择载体主要依据构建的目的，同时还要考虑载体中应有合适的限制酶切位点等。如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。选用哪种载体，还是要结合目的基因及载体特点以实验目的为准绳。 载体选择主要考虑下述3点： 1、构建DNA重组体的目的，克隆扩增/表达表达，选择合适的克隆载体/表达载体。 2、载体的类型： （1）克隆载体的克隆能力—据克隆片段大小（大选大，小选小）。尤其对于病毒载体来说，载体包装容量的大小是评估能否成功包装病毒的首要因素。 ①腺病毒可以插入长约8kb的外源基因。目前，我们包装过长度为7.5kb外源基因的腺病毒。 ②慢病毒的包装容量约为6kb（包含载体带有的其他抗性基因或报告基因），但是2kb以上的外源基因包装慢病毒难度就增加了，增大1kb会下降1个单位数量级的滴度，故2kb以上的基因包装慢病毒需要进行评估。此外，毒性蛋白、凋亡蛋白和膜蛋白（作为受体、转运蛋白行使功能）等由于其本身的功能，包装可能会有一定难度。 ③AAV的总