基因工程主要技术原理.ppt

Agarose gel electrophoresis Gel electrophoresis is not only used as an analytical method, it is routinely used preparatively for the purification of specific DNA fragments. The gel is composed of: ? Agarose: for DNA fragments ranging in size from a few hundred base pairs to about 20 kb (Fig. 2.1). ? Polyacrylamide: for smaller DNA fragments. Agarose gel is a complex network of polymeric molecules whose average pore size depends on the buffer composition and the type and concentration of agarose used. ? In any event, gel electrophoresis is frequentlyperformed with marker DNA fragments of knownsize, which allow accurate size determination of anunknown DNA molecule by interpolation(插入).? In addition to resolving DNA fragments of different lengths, gel electrophoresis can be used to separate different molecular configurations of a DNA molecule. ? Gel electrophoresis can also be used for investigating protein–nucleic acid interactions,based on the observation that binding of a protein to DNA fragments usually leads to a mobility reduction. 1、概述：聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（简称Acr）单体和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）通过化学催化剂（过硫酸铵），四甲基乙二胺（TEMED）作为加速剂或光催化聚合作用形成的三维空间的高聚物。聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构。具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。适用于不同相对分子质量物质的分离，且分离效果好。 核酸杂交是从核酸分子混合液中检测特定大小的核酸分子的传统方法。其原理是核酸变性和复性理论。即双链的核酸分子在某些理化因素作用下双链解开，而在条件恢复后又可依碱基配对规律形成双边结构。杂交通常在一支持膜上进行，因此又称为核酸印迹杂交。根据检测样品的不同又被分为DNA印迹交（Southern blot hybridization ）和RNA印迹杂交（Northern blot hybridization）。 蛋白质印迹(western blot)，又称免疫印迹(immunoblotting) 是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。 Western Blot基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况。Western Blot采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。 Fields等人建立了双杂交系统: （1）以两个蛋白质Snf1（X）和Snf2（Y）为对象, （X）与Gal4的BD结构域融合, （Y）与Gal4的AD结构域融合。 由BD和AD形成的融合蛋白分别称之为“诱饵”(bait)和“猎物”或靶蛋白(prey or target protein)