质粒大抽步骤(强化版)_附件.docVIP

取100ml（根據培養菌體的濃度選擇合適的量，低拷貝推薦用200ml）過夜培養的菌液加入離心管，室溫8，000rpm（~8.228*g）離心3min收集細菌，儘量吸除上清。 注意：菌液較多時可以通過幾次離心將菌體沉澱收集到一個離心管中，菌液量以能夠充分裂解為佳，菌液過多會導致裂解不充分從而降低質粒的提取效率。 儘量吸除上清，為確保上清液全部吸取，請用乾淨的吸水紙吸去瓶壁上的水滴。 step01——加熱洗脫液TB 打開水浴鍋，將溫度設置為65℃，放入洗脫液TB進行水浴加熱。 說明加熱洗脫液是為了增強最後從吸附柱過濾膜中洗脫出質粒的效率。 step02——加入溶液P1 向留有菌體沉澱的離心管中加入8ml溶液P1（請先檢查是否已加入RNaseA，加入RNaseA後的P1溶液須放入4℃冰箱保存），使用移液器或渦旋振盪器徹底懸浮細菌細胞沉澱。 注意請務必徹底懸浮細菌沉澱，如果有未徹底混勻的菌塊，會影響裂解效果，導致提取量和純度偏低。對於低拷貝質粒，加大菌體用量的同時按比例增加P1、P2、P4的用量。 觀察細菌是否徹底懸浮，可將離心管橫放，看是否有塊狀沉澱。 說明溶液P1的成分： 50mMol/L 葡萄糖+25mMol/L Tris-Cl(PH8.0)+ 10mMol/L EDTA(PH8.0)（絡合劑）。 如果菌泥是-20℃冰凍保存的，此時混勻較困難，提前加P1，放置20min，恢復至室溫，