免疫学技术原理与应用第11章-20161129.pdfVIP

免疫学技术原理与应用 PAIT-11 淋巴细胞功能测定 孙 汭 中国科技大学生命科学学院 免疫学研究所 PAIT-11 淋巴细胞功能测定 一、常用的淋巴细胞功能测定 二、T 淋巴细胞功能测定 三、B 淋巴细胞功能测定 四、NK 细胞细胞毒试验 一、常用的淋巴细胞功能测定 1、淋巴细胞增殖实验 ① 3H-TdR 掺入法 原理：淋巴细胞在丝裂原或特异性抗原刺激下转化为淋巴母细胞，发生转化过程中，细 3 胞 DNA 合成大量增多。此时在细胞培养液中加入氚标记的胸腺嘧啶核苷（ H-Thymidine 3 3 riboside, H-TdR), 使 H-TdR 掺入新合成的DNA 中，经β -液体闪烁仪检测淋巴细胞DNA 3 的 H-TdR 掺入量，根据掺入细胞内的核素的量可判断淋巴细胞增殖的程度。 ② MTT 比色法 原理：MTT （（3-4 ，5-二甲基-2-噻唑）-2 ，5-二苯基溴化四唑）是一种黄色可溶性噻唑 盐，掺入细胞后，在细胞活化增殖时通过线粒体能量代谢过程，MTT 代谢形成蓝色的甲攒 （Formazan)沉积于细胞内或细胞周围，形成甲攒的量与细胞增殖程度成正相关。甲攒经异 丙醇溶解后呈紫蓝色，借助酶标仪测定OD 值，可反映细胞增殖水平。 2、细胞毒实验 51 ① Cr 释放法 51 51 51 原理：用放射性核素 Cr （Na -CrO ，鉻酸钠）标记靶细胞， Cr 即可进入靶细胞， 2 4 51 与胞浆蛋白结合。然后将 Cr 标记的靶细胞与待检细胞（效应细胞）共同孵育一定时间后， 51 51 若待检细胞能够杀伤靶细胞，则 Cr 从靶细胞释放出来。 Cr 的释放量与效应细胞的活性 51 成正相关。即靶细胞被杀伤的越多，释放到上清中的游离 Cr 越多，用计数仪测定上清中 51Cr 的放射活性（cpm ）值，以计算待检细胞的细胞毒活性。 51 （一）、用 Cr 铬酸钠标记靶细胞 7 1．用RPMI-1640 培养液洗涤 10 靶细胞，去上清液。用0.5ml 不含碳酸氢钠的完全培 51 养液悬浮细胞。加入100μ Ci （3.7MBq ） Cr 铬酸钠，37℃水浴中标记1 小时，每5～10 分 钟摇晃一次，混匀细胞。 2 ．用RPMI-1640 培养液洗涤细胞3 次，每次400 ×g 10 分钟。用50ml RPMI-1640 培 养液悬浮细胞，置37℃水浴30 分钟，以减少非特异的自然释放。 3 ．离心200 ×g 10 分钟，去上清液。小心用RPMI-1640 培养液悬浮细胞，尽量减少振 5 5 荡引起的细胞损伤以降低靶细胞的自然释放率，将细胞浓度调整为0.5 ×10 或1×10 /ml 备 用。 51 （二）、4 小时 Cr 释放实验 51 1．在96 孔圆底细胞培养板中加入 Cr 标记的靶细胞，每孔加100μ l 。