实验五 PCR引物设计及评价...docVIP

实验五 PCR引物设计及评价 【实验目的】 1、掌握引物设计的基本要求，并熟悉使用Primer premier5.0软件进行引物搜索。 2、掌握使用软件oligo6.0对设计的引物进行评价分析。 【实验原理】 一、引物设计原则 1、引物应在序列的保守区域设计并具有特异性。引物序列应位于基因组DNA的高度保守区，且与非扩增区无同源序列。这样可以减少引物与基因组的非特异结合，提高反应的特异性； 2、引物的长度一般为15-30 bp。常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应； 3、引物不应形成二级结构。引物二聚体及发夹结构的能值过高(超过4.5kcal/mol)易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行； 4、引物序列的GC含量一般为40-60%。过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大； 5、引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)； 6、引物5端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。可根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。 7、引物3’端不可修饰。引物3端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，