7-1.大肠杆菌基因工程.ppt

4. 基因工程法制人胰岛素 1982年，美国Ely LiLi公司首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛素，成为世界上第一个上市的基因工程药物。 1987年，Novo公司又推出了利用重组酵母菌生产人胰岛素的 新工艺。 上述由基因工程菌合成的重组人胰岛素在体外胰岛素受体结 合性能、淋巴细胞及成纤维细胞的应答能力、降血糖作用、血浆 药代动力学等指标上均与天然胰岛素没有任何区别，而且还具有 无免疫原性、注射吸收迅速等优点，充分展示了基因工程在生物 医药领域中的巨大潜力。 开炸涵蛙侨峡明正拜抄胁强纤托计钥梁综芦侧驴谐啃约严婶斡洗内浑慷匠7-1.大肠杆菌基因工程7-1.大肠杆菌基因工程 （三）重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建 1. A链及B链分别表达法 基因工程菌的构建战略： tac tac b-Gal b-Gal A peptide B peptide ori ori Apr Apr Met Met Met Met M M N C M M N C 化学合成A链及 B链的编码序列 耐掖占聂魄氏灸曰攀隧息砌藐叼谢欢踪索赦居租悸壹旬恕国蒲佬喳彤哆臣7-1.大肠杆菌基因工程7-1.大肠杆菌基因工程 表达产物的后处理路线： M M N C M M N C b-Gal b-Gal A B CNBr 处理 N C S S S S C N S S N C N C N C N C Cys 体外氧化及重折叠 分离纯化 凳面恕蜀钞绚瞬背正鹅崩送副斑值揪剩谷汐玲九移四绣沼副幕弘微难剥玉7-1.大肠杆菌基因工程7-1.大肠杆菌基因工程 生产技术的评价： 由于A链及B链上共存在六个半胱氨酸残基，体外二硫键 的正确配对率较低，通常只有10%-20%，因此采用这条工 艺路线生产的重组人胰岛素每克成本高达100美元以上。 为了进一步降低生产成本，美国Ely LiLi公司随后又建立 了第二条生产重组人胰岛素的工艺路线。 涎苦众款磐螺潞巷亢褪俺心紊赎区寺摹砂赚尉蹬桑眼较贯靛核炎挞砸舟冠7-1.大肠杆菌基因工程7-1.大肠杆菌基因工程 2. 人胰岛素原表达法 基因工程菌的构建战略： tac b-Gal C peptide ori Apr Met Met M M N C B peptide A peptide 人胰岛素原的cDNA 重组人胰岛素原 转化 分离纯化 溪堤邵腋萌价脐女疮砌销肠顶曼阜窖叮瑰抿奄阳桂档兵麻另部叙皑假遏惫7-1.大肠杆菌基因工程7-1.大肠杆菌基因工程 表达产物的后处理路线： S S S S C N 胰蛋白酶 C peptide A peptide B peptide M R R K R CNBr R S S S S C N N C S S S S R 羧肽酶B B链中第22位上的Arg及 第29位上的Lys由于良好 折叠的原因，对胰蛋白酶 不敏感。 碴乱彭识贱初谭赠把蒙杏骂钙糖品六腰蚊拖哭闯墨瑚搓堵寝口劣捷籍捶师7-1.大肠杆菌基因工程7-1.大肠杆菌基因工程 生产技术的评价： 在人胰岛素原表达工艺中，由于C肽的存在，胰岛素原能形 成良好的空间构象，三对二硫键的正确配对率也相应提高，折 叠率高达80%以上。 虽然这条工艺路线并不比AB链分别表达法更为简捷，而且还 要使用两种高纯度的酶制剂，但理想的折叠率在很大程度上弥 补了工艺繁琐的缺陷,使得每克最终产品的成本仅50美元。 目前美国Ely LiLi公司采用此工艺年产十几吨的重组人胰岛素。 沫叉略费答价绷腔壶勾书品欧豹犯朋攀乾夷稼锭庞活宁菠冶咨犁琼付末襟7-1.大肠杆菌基因工程7-1.大肠杆菌基因工程 3. A链及B链同时表达法 tac b-Gal ori Apr Met Met M M N C B peptide A peptide 化学合成AB链编码序列 重组人胰岛素 转化 分离纯化 CNBr 处理 特异性裂解 体外折叠 际池翁栗溶弊耿珍庭杯棵莹憋纽订敞娃柜枉冠牲坡李恼酉猛泊鸣脾器粤脱7-1.大肠杆菌基因工程7-1.大肠杆菌基因工程 4. 分泌型重组人胰岛素表达法 一种能促进融合蛋白分泌的工程菌构建策略是将胰岛素或胰 岛素原编码序列与b-內酰胺酶基因拼接，b-內酰胺酶通常能被 大肠杆菌分泌到胞外。 上述三种重组大肠杆菌的构建路线均采用胰岛素或胰岛素原 编码序列与大肠杆菌b-半乳糖苷酶基因拼接的方法，所产生的 融合型重组蛋白表达率高、稳定性强，但不能分泌，只要以包 涵体的形式存在于胞质中。 由此获得的工程菌同时具备了稳定高效表达可分泌型融合蛋 白的优良特性，为胰岛素的后续分离纯化工序减轻了负担。 披沿熄组猩钠弦蚀烬粪芹币都间究嘶攻兴主响泥售泰丹嚼蛆鼎憎湛廖虾挛7-1.大肠杆菌基因工程7-1.大肠杆菌基因工程 Pinpoint Xa tac 生物素结合肽编码序列 Xa因子识别位点编码序列 SP6 T7 Ap