实验十、 乳酸脱氢活性的检测专用课件.ppt

实验十、 乳酸脱氢酶活力测定 目 的 要 求 (1) 了解乳酸脱氢酶活性测定原理。 (2) 学习用比色法测定酶活性的方法。 实 验 原 理 乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase简称LDH）广泛存在于生物细胞内，是糖代谢酵解途径的关键酶之一，可催化下列可逆反应。 LDH可溶于水或稀盐溶液。组织中LDH含量测定方法很多，其中紫外分光光度法更为简单、快速。鉴于NADH, NAD+ 在340nm及260nm 处有各自的最大吸收峰，因此以NAD+为辅酶的各种脱氢酶类都可通过340nm光吸收值的改变，定量测定酶活力，如苹果酸脱氢酶、醇脱氢酶、醛脱氢酶、甘油－3－3磷酸脱氢酶等。 本实验测乳酸脱氢酶活力，是在一定条件下，向含丙酮酸及NADH的溶液中，加入一定量乳酸脱氢酶提取液，观察NADH在反应过程中340 nm 处光吸收减少值，减少越多，则LDH活力越高。 其活力单位定义是：在25℃，pH7.5条件下每分钟A340下降值为1.0的酶量为1个单位。 LDH活力测定 预先将丙酮酸钠溶液及NADH溶液放在25℃水浴中预热。取2只石英比色杯，在1只比色杯中加入0.1mol/L pH 7.5磷酸氢二钾－磷酸二氢钾缓冲液3mL，置于紫外分光光度计中，在340nm处将光吸收调节至零；另一只比色杯用于测定LDH活力，依次加入丙酮酸钠溶液2.9mL, NADH溶液0.1mL，加盖摇匀后，测定340 nm光吸收值（A）。取出比色杯加入经稀释的酶液10mL，立即计时，摇匀后，每隔0.5min 测A340，连续测定3min，以 A对时间作图，取反应最初线性部分，计算每分钟A340减少值。 数据处理 计算每毫升组织提取液中LDH活力单位： LDH活力单位（U）/mL 提取液＝ 注意事项 （1）实验材料应尽量新鲜，如取材后不立即用，则应贮存在－20℃冰箱。 （2）酶液的稀释度及加入量应控制每分钟A340下降值在0.1－0.2之间，以减少实验误差。 （3）NADH溶液应在临用前配制。 思考题 1．简述用紫外分光光度法测定以NAD+为辅酶的各种脱氢酶测定原理。 * 注：稀释倍数为5倍 *