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　　探讨李玲研究组2004 探讨李玲研究组2004_2009年研究工作总结和未来三年工作 导读：李玲研究组2004-2009年研究工作总结和未来三年工作计划李玲研究组2004-2009年研究工作总结和未来三年工作计划 研究方向：植物次生代谢与调控 成员：李玲、洪岚、胡博、刘旭、周文灵、张碧玉、苏良辰、姚瑶、吕旻、赖艳艳 主要研究进展简介： 1. 脱落酸提高花生抗旱分子生理机理研究； 从耐旱花生品种中克隆 AhNCED1基因和AhAO1基因，促进旱胁迫下ABA生物合成的功能，异源表达的转基因拟南芥植株，降低其对水分胁迫的敏感性，将AhNCED1基因转移到干旱敏感花生品种汕优523，使该基因和蛋白在水分胁迫下超表达，与ABA水平的提高一致。花生耐旱品种在干旱胁迫下，营养器官 AhNCED1基因和AhNCED1蛋白表达明显高于敏感品种，与内源ABA含量增加一致，叶片脱水处理1 h ， AhNCED1基因和蛋白表达增强，说明花生叶片对水分胁迫下ABA的生物合成是敏感的早期事件。2008年获得了花生AhNCED1 基因ATG上游的启动子序列，发现序列片段中含有多个ABRE，在转基因拟南芥中表达其活性，水分胁迫、ABA处理均提高其活性。AhNCED1 基因ATG上游的启动子序列与拟南芥同源基因AtNCED3基因的启动子在结构有差异，后者具有ABRE以及DRE。在此基础上从花生中从克隆了AhAREB基因，证实其编码AhAREB蛋白，受干旱和ABA诱导。 将AhNCED1 基因转化花生敏感品种汕优523，抗性芽发生率为100%，存活的抗性芽平均数为1.67。经400 mg L-1 卡那霉素筛选后，48.3%植株PCR 检测阳性，GUS 检测和Southern 杂交阳性率分别为50 %和83.3 %。已经将反义AhNCED1 融合载体转化花生耐旱品种粤油7 号，获得了拟转基因的花生植株，目前正在对拟转基因植株进行生化鉴定和扩大繁殖。随机抽取的抗性拟转基因植株，其中7 株PCR 具阳性 2.葛根素形成相关基因克隆和代谢调控研究 从野葛根中克隆葡糖基转移酶基因PlUGT1和PlUGT2，在野葛的根和叶均有表达，具有葡糖基转移酶保守的PSPG-box 蛋白序列，构建毕赤酵母分泌型表达载体，在毕赤酵母表达系统中表达目的基因PlUGT产物，目前正在证实目的蛋白是否具有催化合成葛根素功能。 建立了从野葛中提取葛根素和用反相-HPLC方法测定C-葡糖基转移酶活性的方法： 用5 mmol/L Tris-HCl（pH 8.1）与材料比3：1提取葛根素， 80%和100%硫酸铵沉淀蛋白，酶反应的最佳体系为：35.5 μmol/L异甘草素，112 μmol/L UDP-G，0.1 μmol/L Tris-Hcl缓冲液（pH8.1，含5 mmol/L DTT）和蛋白浓缩液，反应总体积为220 μl，28℃1h后加入10 μl冰乙酸终止反应。用LC-20AT日本岛津高效液相色谱仪；色谱条件：色谱柱：YMC-Pack ODS-A (4.6*250 mm 3 4 5 6 探讨李玲研究组2004_2009年研究工作总结和未来三年工作 导读：李玲研究组2004-2009年研究工作总结和未来三年工作计划，5μm)；波长254nm；流动相：甲醇：水=70：30；流速：1mL/min；柱温为30℃；进样量10 μl。在0.15－1.3 ug /ul葛根素含量与葛根素峰面积线性关系良好（R2 = 0.9986）。 根据葛根素和大豆甙元在凝胶系统下有较强亮斑的特性，建立了薄层层析法初步鉴定糖基转移酶的性质。相同浓度下葛根素在波长250nm处有较强的吸收峰，而异甘草素有两个吸收峰，分别在250nm和 370 nm处。 3.花卉组织培养中外植体褐变发生机理研究。 蝴蝶兰叶片外植体在MS、B5 和N6 培养基外植体褐变过程中PPO活性增加。50mg/L抗坏血酸和100mg/L硫代硫酸钠浸泡外植体10min，对外植体的褐变有抑制效果。褐变叶片外植体的上表皮变形,维管束破坏,被鞣质填充,褐变外植体分泌到培养基中有鞣质成分。外植体在褐变初期，体内鞣质含量递减，培养第8d到12 d，鞣质含量迅速升高；用0.3 mg/L儿茶素处理外植体，其褐变程度、褐变率和体内鞣质含量明显增加。 褐变的外植体维管束内分布高活性PPO，总酚含量和PAL活力随褐变的加重而增加。外植体离体培养第3天PAL基因表达明显提高，外植体褐变加重，PAL表达水平降低。在Fe 1 盐加倍培养基中培养的蝴蝶兰叶片外植体的PAL mRNA表达量高于对照；比对照早一天出现明显增加，随后表达维持较高水平。 获得蝴蝶兰PPOcDNA全长（PhPPO），获得PPO重组质粒，转化大肠杆菌BL21，0.制备了抗体。克隆蝴蝶兰过氧化物酶家族的