抗体与DNA纯化技术.ppt

抗体纯化技术 沈志扬 产品经理 Bio-Rad 抗体纯化平台 实验室规模分离纯化抗体 Unosphere Q/S 性能参数 更高的选择性和分辨率 10% 穿透载量: Unosphere Q: 150 mg/ml BSA @ 600 cm/hr Unosphere S: 30 mg/ml BIgG @ 600 cm/hr 高流速，低反压 －操作压力: 2 bar @ 1200 cm/hr with 20 cm 更高的碱稳定性 短期 : 1.0 M NaOH @ RT for 1 week 长期 : Storage in 0.1 M NaOH @ RT for 1 year 生产效率大大提高 UNOsphere结构——良好的传质效果 氨基酸残基 典型的阳离子交换 可用中性盐（NaCl）或缓冲盐 (PO4)洗脱 羧基 典型的离子排阻金属螯合机制 结合强度为离子交换的15–60倍 在无PO4盐下不能被任何浓度的NaCl洗脱 用PO4浓度梯度洗脱 Equlibrate: 5mM NaPO4 pH 6.5 Gradient: 5mM–300mM NaPO4 CHT fractionation of contaminants 3-Step Platform purification, UNOsphere SUPrA 3 Step-Platform Purification Aggregate removal by CHT More than 99% reduction by HPSEC Leached protein A removal by CHT 90% removal by Cygnus ELISA reduced from 55 to 5 ng/mL DNA removal by CHT 3 logs reduction by PCR reduced to 1ng/mL by picogreen Endotoxin removal by CHT Spiked with LPS from E.coli, Salmonella, and P. aeruginosa removed 7 x 104 EU by LAL final concentration, IgG pool, 1EU/mL 抗体纯化平台2 产品 抗体纯化平台2 * 无需仪器操作，纯度较低，不易聚集，效价受影响，得率很低 血清和腹水 辛酸沉淀 需要仪器，纯度较高，得率较高，成本较低 血清和腹水 DEAE 蓝胶 无需仪器操作，纯度很低，易聚集，效价受影响，得率很低 血清和腹水 硫酸铵沉淀 需要仪器，纯度很高，得率较高，成本较高 血清、腹水，细胞培养液 Protein A/G 特点 适用样品 技术 治疗用单克隆抗体纯化的可工业放大的实验室研发 纯度、得率要求很高，产物必须符合法规规定 Protein A UNOsphere 离子交换技术 CHT陶瓷羟基磷灰石技术 抗体纯化平台1 实验室规模分离纯化抗体——辛酸沉淀 1、基本原理? ???? 在人、羊或兔血清或含有IgG的培养上清中及小鼠的腹水中加入辛酸, 可与其中大部分蛋白质形成沉淀，而对IgG的性质没有影响，因此是纯化IgG的有效途径。 沉淀后经离心即可获得IgG。辛酸沉淀法与硫酸铵沉淀法比较其主要优点为可减少聚合物的形成，但与其相同，所得的抗体纯度不够，还需用其它方法以进一步提高其纯度。 2、操作步骤? s 用烧杯加20ml 0.06 mol/L醋酸钠缓冲液（pH4.0）到10ml血液、腹水中； s 用1N HCl调节pH到4.8，后滴加辛酸同时用力搅拌，辛酸具体用量参见表1； s 在室温下继续搅拌30分； s? 5，000 ×g 室温离心30分，保留上清； s? 用1N NaOH 调节pH到5.7； s? 含有IgG的上清可以调节pH值后直接上柱精纯，或对PBS透析，然后分装、置-20℃保存。? 表1? 沉淀不同来源IgG的辛酸参考用量? 小?? 鼠??????????????????400μl 人??????????????????????? 700μl 羊??????????????????????? 700μl 兔??????????????????????? 750μl IgG来源????????? 辛酸用量（每10ml血液、腹水或上清） 注：必要时需要摸索填加量，以达到最高的纯度和得率。 抗体纯化平台1 实验室规模分离纯化抗体——DEAE Affi-Gel蓝胶 快速去除白蛋白和血纤维蛋白溶酶原 一次纯化血清或腹水中的抗体 去除血清中的HSA 应用 15-25cm/hr 15-25cm/hr 15-25cm/hr 建议流速 2-6mL血清/ml 0.2-1mL血