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DNA分子定量技术研究 　　摘 要：核酸的序列、多样性和丰度分析是现代生物学的基础。DNA定量检测在肿瘤早期研究、产前检查、环境微生物分析、遗传病研究等方面具有广泛的应用前景。本文介绍了三种核酸定量技术，包括光度分析法、荧光定量PCR技术和数字PCR技术，系统阐述了各项技术的原理、特点及其应用，并对各方法的优缺点进行了比较，以供广大科研工作者在实际检测工作中借鉴和运用。 　　关键词：PCR技术；定量；DNA检测 　　中图分类号：TS261.1 文献标识码：A 文章编号：1671-2064（2017）02-0255-02 　　DNA双螺旋结构的发现是20世纪最伟大的科学发现之一，标志着生物学研究进入了分子水平。1985年聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）被提出，极大程度地促进了DNA研究的发展。DNA分子定量检测作为生物学领域中一项基本的技术，具有广泛的应用前景，包括肿瘤早期研究、产前检查、环境微生物分析、遗传病研究等。目前，DNA分子定量测量技术主要包括荧光定量PCR技术、数字PCR技术以及光度分析法。 　　现将有关研究情况报告如下： 　　1 荧光定量PCR 　　1.1 荧光定量PCR原理 　　荧光定量PCR（fluorescence quantitative PCR）简称为qPCR，使目前运用最广泛的DNA定量技术。它的原理为：进行PCR扩增时，通过加入一个特殊的荧光探针，对PCR产物标记跟踪。每增加一条DNA序列，就会出现一个新的荧光分子，使荧光分子信号与PCR产物浓度形成一定关系，再利用相关软件分析，计算待测序列的初始数量。 　　理论上PCR的过程应该为指数增长，但实际上扩增曲线并不是标准的指数图像，而是S形曲线。原因是，当循环次数增加时，引物、Taq酶、DNA模板等浓度逐渐降低，PCR的效率随之下降，产物增长的速度也逐渐下降。当所有Taq酶饱和之后，PCR即进入平台期。不同的PCR反应由于各种因素的影响，难以精确控制其进入平台期的时间以及平台期高度。因此PCR实验的可重复性并不高，结果存在较大差异。 　　qPCR通过实时监测荧光信号来克服这一弊端。传统的qPCR认为在指数扩增的初始阶段，样品间的细小误差并未放大，可认作扩增效率恒定。达到阈值前循环次数记为CT（cycle threshold），对每个循环进行实时荧光检测。对于任一个PCR反应，到达循环阈值时有： 　　Nt=N0（1+ E）CT 　　其中，N0为初始模板的拷贝数，Nt为第CT个循环时产物的拷贝数，E为扩增效率。对于特定的PCR反应，CT个循环的拷贝数Nt和扩增效率E均为定值，因此CT仅由初始模板数量N0有关。由此可以得到初始DNA的数量。 　　1.2 荧光定量PCR特点 　　实时荧光定量PCR的发明，极大地简化了定量检测的过程，并实现了真正的绝对定量。这种技术保证了工作效率，反应迅速、灵敏度搞、可重复性强、特异性号，结果清晰。 　　荧光定量PCR也具有一定缺点：由于在PCR扩增的过程中，有很多因素可能会影响其扩增效率，例如引物浓度、温度、酶等，因此其扩增效率难以保持恒定，导致准确度下降。同时，由于qPCR的结果需要与校准物标准曲线进行对比，依赖外标，是一种相对定量的方法。 　　1.3 荧光定量PCR应用 　　目前主要的应用有：（1）临床疾病诊断及疗效评估，包括艾滋病、结核、各种肝炎等；优生优育检测，包括血友病、胎儿畸形、性别发育异常、地中海贫血等；肿瘤诊断，通过检测肿瘤标志物或部分肿瘤基因；遗传病检测。（2）动物疾病检测，包括口蹄疫、禽流感、猪瘟、炭疽芽孢杆菌等。（3）食品安全检测，包括食物过敏源、转基因、微生物等。（4）科学研究，在医学、生物学、农业等领域。 　　2 数字PCR 　　2.1 数字PCR原理 　　数字PCR（digital PCR），简称dPCR，是一项核酸定量检测的新技术。不同于传统的荧光定量PCR，该技术不依靠任何外标实现直接计数目标物。将样本稀释至达到单分子水平，平均分配到几十至几万个芯片微反应器中进行反应。这样的分配方式可以保证分子独立扩增，消除了本底信号的影响，提高了靶标扩增的灵敏度。扩增结束后采集每个反应单元的荧光信号，最后通过直接计数或者泊松分布公式计算得到样品的原始浓度或含量。 　　PCR扩增结束后，记有荧光信号的单元为1，不含有荧光信号的单元为0，其中有荧光标记的反应单元里至少含有一个拷贝的目标分子。由于扩增前进行稀释，可以认为样品中目标DNA的浓度极低，有荧光标记的反应单元数等于目标分子的拷贝数。在一般情况下，各个反应单元中可能包含两个或以上的目标分子，所以采用泊松分布公式计算。 　　数字PCR的分辨率指的是对目标基因的识别能力，除了与