新型重组人干扰素类似物的表达、纯化及活性测定.pdfVIP

  中文摘要 新型重组人干扰素类似物的表达、纯化及活性测定  干扰素是一类非常重要的具有抗病毒活性的细胞因子，在非特异性免疫应答 以及抵抗病毒入侵的防线中起着关键的作用。干扰素分为三类：I 型、II 型和 III 型。其中 I 型干扰素，尤其是其中的 IFN-α受到的关注最多，许多 IFN-α相关制 剂已经应用到临床治疗中，尤其是在治疗丙型肝炎病毒（HCV ）感染方面，I 型 干扰素具有其不可动摇的地位。 丙型肝炎如今已经呈现大规模全球性流行的趋势，尤其是在我国。丙型肝炎 病毒会造成肝脏出现一些慢性炎症，严重时会导致肝脏出现纤维化甚至是肝坏 死，部分会发展为肝硬化，甚至转成肝癌。未来几年由丙型肝炎病毒感染造成的 死亡率将会持续增加，它已经成为了一个严重影响社会和公共卫生安全的问题。 当前对于慢性丙型肝炎的治疗包括重组聚乙二醇（PEG ）IFN-α加上利巴韦林， 尽管这种治疗在超过半数的个体中能够产生较为持久的抗病毒应答，但由于 I 型 干扰素作用的广谱性，因而在治疗作用之外伴随着一些较为严重的副作用。 2002-2003 年发现的 III 型干扰素在功能上与 I 型干扰素相似，均能诱导细胞 至抗病毒状态。与 I 型干扰素不同的是，III 型干扰素作用的细胞较为局限，主要 包括上皮细胞和肝细胞，因此其副作用也大大降低。这证明 III 型干扰素在治疗 病毒感染和肿瘤方面将会是替代 I 型干扰素的潜在药物。III 型干扰素在问世后， 由于其具有抗病毒活性，并且副作用少的特点，已呈现出取代IFN-α治疗丙型肝 炎的趋势。III 型干扰素虽然具有与 IFN-α 相似的抗病毒活性，但是其抗丙型肝 炎病毒的疗效却不如 IFN-α。另一方面，天然 III 型干扰素在体外重组基因工程 菌种中较难表达和纯化也是制约它们快速取代 IFN-α的一个重要因素。 本课题基于上述治疗现状，通过分析 III 型干扰素家族成员的基因序列和蛋 白功能结构域的特性，利用生物模拟等方法，设计出一系列编码人III 型干扰素 类似物的新型基因序列。然后运用基因工程方法，在大肠杆菌工程菌中表达后， 通过筛选最适复性条件，得到恢复三维结构的复性后蛋白；运用高效液相色谱、 亲和层析和离子交换层析等蛋白分离纯化技术手段，获得高纯度的重组蛋白；最 后选择 HepG2 细胞系进行重组蛋白抗病毒活性的测定，选择两种与细胞抗病毒 I     应答相关的蛋白：Mx （黏蛋白抵抗蛋白）和OAS （2’,5’-寡腺苷酸合成酶）作为 报告基因，运用实时荧光定量 PCR 技术方法进行抗病毒效果的评价。通过一系 列体外表达、复性、分离纯化、活性测定的实验探索，筛选出 3 个较天然 III 型 干扰素更易于表达、能诱导细胞产生抗病毒活性的新型重组人 III 型干扰素类似 物，为研制疗效高，产量大，成本低，最重要的是副作用少的重组干扰素药物奠 定基础。 关键词： 干扰素类似物，蛋白表达，蛋白纯化，活性测定 II     Abstract Expression, Purification and Activity Assay of New Recombinant Human Interferon Analogues Interferon is a very important cytokine with high antiviral activity. It plays a key role in innate immune responses, as w