水环境污染中鱼类遗传毒性响应的RAPD研究.pdfVIP

中文摘要 ／ DNA)是在聚合酶链 Polymorphism Amplified 恼机扩增多态性DNA(Random reaction chain PCR)技术基础上发展起来的一门新方法。 式反应(polymerase 它以10个碱基的任意序列的寡聚核苷酸片段为引物，在未知序列的基因组DNA 上进行随机的PCR扩增。这种被聚合酶调节的扩增是一个复杂的、动态的化学 反应系列。在这些反应中引物将同源序列从非同源的竞争位点中被识别出来并 确定之后的扩增效率，在模板、扩增产物、酶、引物及dNTP浓度之间的平衡随 每个温度周期而变。不同种类的分子彼此相互作用，最后合成PCR产物。在基 因组上，某--zJI物可能会与单链DNA上的多个位点rL{t结合，但只有这些引物 的位置在彼此可扩增的距离内(引物间距为200—2000bp)，一组不连续的分子量 没有反向平行的与引物相对应的互补链，则每次扩增只能增加一条新链，如果 双链DNA分子在～定长度内具有反向平行又与引物互补的片段，则经过N次循 环后就可以合成2。条新链，如此高产的DNA片段经电泳分离后即会在成像系统 上记录下RAPD指纹，这些扩增DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA 多态性，如果基因组相应区域的DNA发生变化，就可能导致这些特定结合位点 的分布发生相应的变化并进而导致PCR产物的变化。本文通过建立一套相关模 式生物种的特定引物系列的RAPD数据库，为遗传毒性的判别提供有效的快速筛 、 ／ 选方法。Y 本文采用斑马鱼(Danio 代开始，Streisinger等人对斑马鱼进行了深入的研究，发现斑马鱼本身存在 着发育周期短，产卵量大且胚胎透明可见等优点，这些特点已使之迅速成为了 理想的脊椎动物发育生物学和毒性试验的模式生物种。通过抽提动物组织DNA 的方法提取得到的斑马鱼的基因组DNA，在电泳后出现稳定均一的条带，其分 取得到的斑马鱼基因组DNA无污染、无降解，适合于进行随机扩增多态性DNA 分析。文中选用了AmershamPharmacia公司的随机扩增引物系列，对受试斑马 鱼的基因组DNA进行扩增，其结果显示所有的6条引物都扩增得到了数条至十 几条的指纹条带，说明该组引物系列对斑马鱼的基因组DNA具有较高的扩增效 率，以其作为分子标记是有效的。通过对22条正常斑马鱼的基因组DNA的随机 扩增，该引物系列共得到了78条扩增条带，经汇总后，出现频率在30％以上 的有46条，出现频率在60％以上的有21条，在所有的诈常的斑马鱼中都出现 硕士学位论灭 号引物的495bp，这4根条带可以被认为在该方法基础上『F常斑马鱼的稳定条 带，代表了所有jF常斑马鱼基因组中的共性，出现频率在60％以上的则代表了 在多数『F常斑马鱼中共同存在的特征，而出现频牢在30％以下的则代表了不同 斑马鱼个体的基因组特性。本文分别以稳定条带(4条)和常见条带(出现频率在 60％以上的2l条)数据库作为判别依据，将未知样品指纹模式与『F常指纹模式 用SPSS软件的类问平均连锁方法进行聚类分析，最终在稳定条带和常见条带两 个层次上，依次判定样品是否产生遗传毒性效直。 ～、 纹中的稳定条带有缺失，其指纹模式与常见条带模式经SPSS中类间平均连锁方 法的聚类分析，其条带数据集合与『F常常见条带模式之间有明显距离，因此根 据以上两种判别依据都可判定其为遗传毒性阳性，O．05ppm环磷酰胺作用96小 时的斑马鱼其RAPD分析无稳定条带缺失，但其指纹与常见条带模式间存在一定 失，在常见条带的聚类分析中其与正常模式间也存在明显的距离。对农药乐果 鱼，其RAPD指纹经稳定条带和常见指纹模式聚类分析均呈阳性，而在1．Oppm 浓度乐果的水溶液中暴露96小时后的斑马鱼RAPD指纹经两种方法的分析结果 都呈阴性。 在对环境水样进行的研究中，选择7月份上海境内的苏州河河水为暴露介 质，将斑马鱼放入特制筐内原位放养两周，取其基因组DNA进行RAPD分析，结 果发