动物细胞培养生物反应器(可编辑).docVIP

动物细胞培养生物反应器 植物细胞培养生物反应器 植物细胞培养是指在离体的条件下,将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中,进行振荡培养,得到分散成游离的细胞,通过继代培养使细胞增殖,从而获得大量的细胞群体的一种技术。植物细胞含有人类所需的成分,而传统的方法从植物中提取分离这些成分已很难满足人们的需求。近年来,利用植物细胞培养来生产有用代谢产物已受到广泛的关注,但是,只有一小部分的产品已成功用于商业化生产,其原因是反应器设计、过程发展以及对反应机理知识的欠缺等工艺上的限制。植物细胞生长缓慢、需氧低,此外,由于它们体积较大、细胞壁较厚、液泡较大而对剪切敏感。因此气升式和柱状生物反应器应用较为普遍。随着植物细胞悬浮培养技术的逐步完善,单细胞培养的成功,各种新型生物反应器的问世,利用植物细胞培养技术成为大规模生产植物代谢产物的有效途径。 一、植物细胞培养过程 植物细胞培养按照培养对象可分为单倍体细胞培养和原生质体培养;按照培养基可分为固体培养和液体培养;按照培养方式可分为悬浮培养和固定化细胞培养。 单倍体培养 一般是指花药在人工培养基上进行培养,从小孢子(雄性生殖细胞)直接发育成胚状体,然后再长成单倍体植株;也可以通过愈伤组织诱导分化出芽和根,最终长成植株。 原生质体培养 将植物的体细胞(二倍体细胞)经纤维素酶等去掉细胞壁处理后,获得的原生质体(protoplast)在无菌培养基上生长、分裂,最终长成植株。也可以将不同植物的原生质体融合而获得体细胞杂交的植株。 固体培养是在微生物培养基础上发展起来的植物细胞培养的方法。培养基添加一定比例的琼脂配制,用培养皿、三角烧瓶或试管分装,经高压灭菌冷却凝固后接种经消毒过的外植体,整个过程需无菌操作。 液体培养 也是在微生物培养基础上发展起来的,可分为静止与振荡两种。静止培养无需任何设备,适合某些原生质体的培养。振荡培养需要摇床或转床等设备,可使培养物充分混合以利于气体交换。 细胞悬浮培养 是一种使组织培养物分离成单细胞并不断扩增的液体培养技术。在进行细胞培养时需要提供容易碎裂的愈伤组织进行液体培养。与微生物培养相似,植物细胞的悬浮培养也包括分批培养、半连续培养(也叫流加培养)、连续培养三种方式。目前,植物细胞大规模培养主要采用悬浮培养方式,这主要是由于悬浮培养可以增加培养细胞与培养液的接触面,促进营养的吸收;可带走培养物产生的有害代谢产物,避免高浓度积聚对细胞的伤害;可保证良好的混合状态,从而获得良好的气体传递效果;可以借鉴发酵工程的成熟技术,容易放大实现规模化。 固定化细胞培养 是在微生物和酶的固定化培养基础上发展起来的。是固体培养的一种,但不是使用固体培养基,而是与固定化酶或固定化微生物细胞培养类似的一种植物细胞培养技术,目前应用最广泛的、能很好保持细胞活性的固定化方法是将细胞包埋于海藻酸盐或卡拉胶中。具体培养方法将在下一节中介绍。 (一)植物细胞培养基 对植物细胞的生长而言,培养基的组成成分是一个决定性的因素。植物细胞培养与动物细胞培养相比,其最大的优点是植物细胞能在简单的合成培养基上生长。其培养基主要由无机盐类、碳源、维生素、植物生长激素、有机氮源、有机酸等组成。 1.无机盐类 对于不同的培养对象和形式,无机盐的最佳浓度是不相同的。通常在培养基中至少含有25mmol/L的硝酸盐和钾。虽然硝酸盐可以单独作为无机氮源,但是加人一点铵盐对细胞生长有利。如果铵盐单独作为氮源,添加一些琥珀酸或其他三羧酸循环酸效果更好。对常规的愈伤组织培养和细胞悬浮培养来说,硝酸盐加上铵的浓度可达到60mmol/L,说明铵可能对某些培养物有重要作用。镁、钙和硫元素的浓度在l~3mmol/L范围较为合适。所需的钠、磷和氯化物有钙盐、磷酸盐和微量营养物提供。微量元素包括碘、锰、锌、钼、铜、钴和铁。 2.碳源和能源 蔗糖或葡萄糖是常规的碳源,而果糖的利用效果较差。其他糖类均不合适作为单一的碳源。培养基中蔗糖被迅速分解为葡萄糖和果糖,葡萄糖首先被利用,然后再利用果糖。大多数植物细胞对蔗糖的需求范围是2%到4%。通常增加培养基中蔗糖的含量,可增加培养细胞的次生代谢产物量。 3.植物生长激素 植物激素是培养基中不可缺少的组成部分,大多数植物细胞培养基中都含有天然的和合成的植物生长激素。通常激素可分为二类:生长素和细胞分裂素。生长素能促进细胞分裂,常用的有吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)、2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)和萘乙酸(NAA)。前两种不稳定,能被细胞释放的酶降解,而后两种被细胞降解的较慢,对热稳定。细胞分裂素常用的是6-苄基瞟怜(6-BA),激动素(kt)和玉米素(zeatin)。将分裂素和生长素一起使用,效果更佳。