CreLoxp重组系统的修饰及其在树干毕赤酵母中的应用.pdf

摘 要 摘 要 树干毕赤酵母 （Scheffersomyces stipitis ）能够将木糖有效的转化成乙醇，是最具工 业生产前景的戊糖酵母之一。自然界中有丰富的植物纤维资源，充分合理利用这些农林 废弃物，通过生物转化生产对人类有用的产品，具有十分重要的的现实和长远意义。野 生型菌株对木糖的转化率及菌体生长量还未达到工业菌株的要求，而在酿酒酵母 （Saccharomyces cerevisiae ）搭建的木糖代谢途径并未实现木糖有效地转化成乙醇。因 此，通过对S. stipitis 进行基因工程操作来提高木糖转化率，以及构建一株新型的酵母基 因工程菌，已经成为研究热点。但S. stipitis 具有编码偏好性，密码子CUG 识别Ser， 而不是常见的Leu，导致富含CTG 的外源基因在S. stipitis 中不能表达或表达效果不佳， 限制分子生物学技术的应用。本论文构建适用于S. stipitis 的筛选标记并通过定点突变修 饰Cre/Loxp 重组系统，实现乙醛脱氢酶Ⅴ基因 （Aldehyde dehydrogenase 5，ALD5 ）无 痕敲除，为S. stipitis 的遗传转化研究提供基础工具，并以此为基础为开发外源基因表达 体系奠定基础。 本论文对S. stipitis 染色体倍性进行验证。使用DNA 含量参比法对S. stipitis 染色体 倍性进行了分析，根据S. cerevisiae 单倍体与二倍体染色体含量的特征性差异，测定DNA 含量并分析，确定S. stipitis 为单倍体细胞。 构建尿嘧啶营养缺陷型和抗药性筛选标记为分子生物学操作作准备。通过重叠PCR 法构建S. stipitis URA3 基因同源重组片段。双交换同源重组敲除URA3 基因，获得尿嘧 - 啶营养缺陷型菌株S. stipitis （ura3 ）。酵母中常用抗性筛选标记有G418 和Hygromycin B ，实验结果表明该菌株对 G418 具有较强抗性，对 Hygromycin B 较敏感，选择 Hygromycin B 作为新的抗药性筛选标记。 Cre/Loxp 系统中含有Cre 重组酶基因和Hygromycin B 抗性基因两个外源基因，将 CDS 区中CTG 密码子定点突变成TTG，在S. stipitis 中编码有活性的蛋白。以ALD5 为 靶基因，构建ALD5 基因同源臂片段，同时中间插入含Loxp 位点的 URA3 基因作为选 - 择标记，敲除其ALD5 基因，获得重组菌S. stipitis （ald5 ）。半乳糖诱导Cre 重组酶表达 - - 并切除URA3 基因，获得菌株S. stipitis （ald5 ura3 ），重组率达到50%，GAL 启动子可 以在S. stipitis 中启动外源基因的转录。 关键词：树干毕赤酵母；Cre/Loxp 重组系统；定点突变；尿嘧啶营养缺陷型；潮霉素B I Abstract Abstract Scheffersomyces stipitis has the capacity to ferment xylose to ethanol. It is one of the most industrial prospect pentose yeasts. There are abundant plant fiber resources in nature,and such Agricultural