树干毕赤酵母纤维二糖代谢功能基因的克隆和分析.pdf

摘 要 摘 要 植物纤维质是地球上最为广泛、最为廉价的资源，可以说“取之不尽，用之不竭”， 是最有利用价值的资源之一。随着石油等不可再生资源的日益匮乏，植物纤维质越来越 受到研究者的重视，利用植物纤维质发酵燃料乙醇成为能源利用的新方向。 在纤维素代谢过程中，β-葡萄糖苷酶活性较低，常常因为纤维素酶的不足使纤维二 糖积累，而纤维二糖的积累会反馈抑制纤维素酶的催化作用，因此纤维二糖具体代谢过 程的研究十分迫切。树干毕赤酵母作为能够水解植物纤维素的微生物，已被证明具有良 好的转运和利用纤维质的能力，成为最具工业运用前景的热点菌株之一。 为了找到树干毕赤酵母的β-葡萄糖苷酶基因，实验构建了该菌的基因组文库做为研 究其纤维二糖代谢的平台，该文库有大约 3000 个阳性克隆子；克隆子中的基因片段大 小在0.5-8 Kb 之间，大多数片段在5077 bp 处，文库中重组载体上有插入片段的比例为 70% - 80%；该文库覆盖了树干毕赤酵母1.08 倍的基因；从该文库筛选到树干毕赤酵母 任一DNA 序列的精确概率为97% 。文库构建完成后，根据β-葡萄糖苷酶对其底物纤维 二糖的底物特异性，设计了以纤维二糖为唯一碳源的培养基YNBC 。提取文库中克隆子 所含重组质粒，醋酸锂法转化酿酒酵母W303-1A，涂布该平板进行筛选。筛选得到了一 个能够利用纤维二糖生长的重组菌，提取重组菌所转入的质粒，测序得到一段 1.8 Kb 的基因片段，命名为BGL-X 。 通过NCBI 数据库中的BLAST 工具检索BGL-X 片段，发现该片段由三部分组成， 片段1：1485 bp ，经BLAST 检索应为线粒体细胞色素酶C 基因；片段2 ：193 bp ，第 五条染色体基因，定位1656709-1656517 bp 处；片段3 ：143 bp ，第四条染色体基因， 定位934740-934884 bp 处。为了确认哪段基因在起作用，构建了重组质粒pYX212-X123 、 pYX212-X12 、pYX212-X13 、pYX212-X23 、pYX212-X1 、pYX212-X2 和 pYX212-X3 。 将重组质粒转化酿酒酵母W303-1A，构建了各重组质粒的重组菌，pNPG 法检测β-葡萄 糖苷酶酶活显示只有含基因片段2 在内的X123 和X12 片段表达了β-葡萄糖苷酶，这意 味着基因片段 2 可能在 β-葡萄糖苷酶的表达中起到重要作用。在 NCBI 数据库上的 BLAST 工具检索片段2 碱基序列，发现其位于树干毕赤酵母第五条染色体上一段3877 bp 的未注释序列中。利用NCBI 中的工具ORF Finder 对这段未注释序列进行开放阅读 框预测，得到一段1020 bp 的开放阅读框，其中包含片段2 ，命名为BGL 。为了进一步 验证BGL 基因的作用，构建了重组质粒pET28a-BGL 和pYX212-BGL ，将重组质粒分别 转化大肠杆菌BL21 和酿酒酵母W303-1A 进行异源表达，构建了重组菌大肠杆菌E.coli BL21 (PT7-BGL)和酿酒酵母W303-1 A (PTP1-BGL) 。检测重组菌β-葡萄糖苷酶酶活显示 BGL 基因表达了纤维二糖基因。将BGL 的基因序列提交NCBI ，获得登录号KC677697 。 关键词：树干毕赤酵母，基因组文库，筛选，纤维二糖, β-葡萄糖苷酶 I Abstract Abstract Plant fiber is the most widely, the most cheap resources on the earth, which is “inexhaustible in supply and always available for use”, and it is one of the most useful resources. As