In vitro evaluation of DCs targeted thermosensitive siRNA nanoparticlesDCs靶向温敏性siRNA纳米载体的体外评价.pdfVIP

DCs 靶向温敏性siRNA 纳米载体的体外评价 中文摘要 目的：利用 siRNA 干扰技术抑制树突状细胞中凋亡基因 Bak 的表达，在细胞水 平上进行了 siRNA 抑制效果的评估。但是，siRNA 的给药系统方面尚存不足，如靶 向性低，转染率低和体内不稳定等因素。所以，设计有效负载靶向DCs 中 Bak 基因 的 siRNA 药物载体系统，对提高 DCs 的抗原提呈能力、促进免疫应答和增强抗肿瘤 作用均具有非常积极的意义。本文基于 DCs 表面特异性表达的 DEC-205 受体，制备 了负载 siRNA 的DEC-205 抗体修饰的温度敏感性纳米胶束，并对其制剂学特征、细 胞毒性、靶向性、摄取率、摄取机制、siRNA 的内涵体逃逸及沉默效率和 DCs 存活 率等方面进行评价，为构筑安全有效的抗肿瘤 siRNA 疫苗载体系统提供理论依据。 方法：首先，在前期研究的基础上，合成并表征了 DEC-205 修饰的温度敏感性 泊洛沙姆接枝壳聚糖聚合物（DEC-205-Po-CS ），并对该聚合物纳米胶束的粒径、Zeta 电位、包封率、温敏性、稳定性和细胞毒性进行了评价。其次，体外分离小鼠骨髓中 单个核细胞，利用细胞因子诱导分化获得 DCs ，以Lipofectamine 2000 作为对照，通 过流式细胞仪考察了 DCs 对负载 FAM-siRNA 的DEC-205-Po-CS 纳米胶束的摄取率。 原子力显微镜观察 DCs 对纳米胶束的内吞作用，利用内吞抑制剂进一步阐释内吞的 具体路径，荧光显微镜观察冷休克对细胞内涵体形态的影响。最后，利用 Western Blot 和 RT-PCR 评价了 Bak 基因沉默效率，并采用凋亡试剂盒测定了转染负载沉默 Bak 的 siRNA 纳米胶束后 DCs 的存活率。 结果：红外光谱、核磁共振图谱及热重分析结果证实了泊洛沙姆接枝壳聚糖聚合 物的合成，其 CMC 值为（1.20±0.10）×10-6 mol·L-1 。制备的载药纳米胶束粒径为 （230.9±3.9 ）nm ，Zeta- 电位为+ （14.57±1.12）mV ，包封率为（85.6±2.37 ）%，重现 性均良好。流式细胞仪检测表明 DEC-205 修饰纳米胶束可提高 DCs 的摄取率。原子 力显微镜观察 DCs 通过内吞作用摄取纳米胶束，主要是网格蛋白介导的内吞，少部 分是小窝蛋白介导内吞，并且是一个消耗能量的内吞过程。荧光显微镜观察冷休克后 温敏性纳米载体膨胀，导致内涵体破裂，实现 siRNA 从内涵体逃逸。Western Blot 结 I 果证明，负载 siRNA 的DEC-205-Po-CS 纳米胶束转染 imDCs 3 h 后进行冷休克，并 且冷休克的时间为 15 min 时，蛋白的表达量较低，蛋白表达抑制率为（81.81±6.89 ） % ；RT-PCR 结果表明，脂质体 2000 转染组；DEC-205-Po-CS 转染组；DEC-205-Po-CS 转染加冷休克组对 DC 细胞 Bak 基因有明显的抑制作用，均能显著下调 Bak mRNA 的表达。流式细胞仪检测 DCs 凋亡结果，DEC-205-Po-CS 加冷休克组 DCs 存活 率（73.62±3.93 ）% ，明显高于对照组（28.89±3.09 ）%和脂质体 2000 转染组 （42.84±2.53 ）% 。 结论：本文制备了温度敏感性 DEC-205 修饰的泊洛沙姆接枝壳聚糖聚合物纳米 胶束，未见明显细胞毒性。温度敏感性纳米胶束能有效负载 siRNA 特异性靶向 DCs ， 提高细胞摄取率。树突状细胞通过网格蛋白和小窝蛋白介导的内吞摄取纳米胶束，冷 休克实现了 siRNA 的内涵体逃逸。利用 siRNA 干扰技术抑制了树突状细胞中凋亡基 因Bak 的表达，延长了的DCs 寿命。 关键词：树突状细胞，siRNA，温度敏感性纳米胶束，DEC-205 作 者：浦 洁 指导老师：崔京浩