无菌检埠烷方法学验证实验年月.ppt

无菌检查法及《中国药典》2005年版无菌检查法中方法验证试验 2005版 《中国药典》 张春华 一·无菌检查法 1.基本定义 无菌检查是检查要求无菌的药品.医疗器具.原料.辅料.以及要求无菌的其他物品是否染有活菌的一种方法。 符合无菌检查法的规定仅表明了供试品在该检验条件下未发现细菌和真菌污染。 2·需进行无菌检查的药品、敷料、灭菌器具的范围 各种注射剂 眼用及外伤用制剂 植入剂 可吸收的止血剂 外用敷料、器材 3·环境要求 环境洁净度10000级和局部洁净度100级的单向流空气区域 一般要求 18～26℃ 45％～65％ 例行消毒处理 洁净度检查 4·仪器及用具 无菌室内常备器具 恒温培养箱及生化培养箱 离心机，显微镜，高压蒸汽灭菌器，恒温烤箱，开放或全封闭过滤系统等 玻璃器皿 无菌衣，裤，帽，口罩 除菌滤器及滤膜 培养基的装量 培养基的适用性检查 培养基的无菌性检查 培养基的灵敏度检查 培养基的灵敏度检查 硫乙12ml，9支，4株菌，各1ml，每种培养基各接种2支（原3支），另1支培养基空白对照。培养3d(原5天)。 改良马丁9ml，5支，2株菌，各1ml，每种培养基各接种2支（原3支），另1支培养基空白对照。培养5d。 结果判定 空白管培养基无菌生长，加菌的培养基管均生长良好，判灵敏度检查合格。 （原3支管有2管生长，合格。） 6·菌种及菌液制备 菌种的保藏和传代 甘油冷冻管保藏法 斜面低温保藏法 菌种 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) [CMCC(B) 26003] 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) [CMCC(B) 10104] 生孢梭菌(Clostridium sporogenes) [CMCC(B) 64941] 白色念珠菌(Candida albicans) [CMCC(F) 98001] 黑曲霉(Aspergillus niger) [CMCC(F) 98003] 菌液制备 一般当日使用 金葡·铜绿的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，30～35℃培养18～24h 黑曲霉菌接种至改良马丁琼脂斜面培养基中， 20～25℃培养5～7d 检验方法必须验证 薄膜过滤法验证试验 直接接种法验证试验 判断 1.薄膜过滤法 将规定量的供试品按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入小于100 cfu的试验菌。取出滤膜接种至相应的培养基中，或将培养基加至滤筒内。取一支装有同体积培养基的容器，加入等量的试验菌，作为阳性对照，按规定温度培养3～5天。各试验菌同法操作。 2.直接接种法 取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基8支，分别接入金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌的菌悬液1ml(含菌小于100 cfu)各两管；取符合直接接种法培养基用量要求的改良马丁培养基4管，分别接入白色念珠菌、黑曲霉菌的菌悬液1ml(含菌小于100 cfu)各两管。其中1管接入规定量的供试品，另1管作为阳性对照，按规定的温度培养3～5天。 3.阳性对照 应根据供试品的特性选择相应的 阳性对照菌： 无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品，以金黄色葡萄球菌为对照菌 抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌； 抗厌氧菌的供试品，以生孢梭菌为对照菌； 抗真菌的供试品，以白色念珠菌为对照菌。 3.1.阳性对照试验的菌液制备 同培养基灵敏度检查（大肠埃希菌的菌液制备同培养基的灵敏度检查中的金黄色葡萄球菌），如菌量为小于100cfu， 供试品用量 同供试品无菌检查每份培养基接种的样品量（见药典附录表2、表3）。 阳性对照管培养48～72小时应生长良好。 (二)检查法 有直接接种法和薄膜过滤法。 1.薄膜过滤法 强调了要“优先采用封闭式薄膜过滤器，也可用一般薄膜过滤器。” 无菌检查用的滤膜孔径为0.45μm与直径为50mm。 根据供试品及溶剂的特性选择滤膜的材质。如抑菌性供试品采用具有疏水性边缘及低吸附性的滤膜。 滤器及滤膜采用适宜的方法灭菌； 使用时，要保证滤膜的完整性； 水溶性供试品，先用少量冲洗液湿润滤膜。油类供试品，滤膜和滤器，在使用前应充分干燥，备用。 过滤时，保持供试液及冲洗液覆盖整个滤膜表面； 冲洗滤膜时，每张滤膜每次冲洗量为100ml，冲洗液、冲洗量及冲洗方法与方法验证相同。 1.1供试品的处理 供试品分8类，增订5种：③④⑤