DNA连接酶与.pptVIP

DNA连接酶 催化机理: DNA连接酶能催化双链DNA切口处的5’-磷酸根和3’-羟基生成磷酸二酯键。 这种反应需要供给能量，大肠杆菌和其他细菌的DNA连接酶以NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)作为能量来源，动物细胞和噬菌体的连接酶则以ATP作为能量来源。 DNA连接酶的作用机制分三步进行： 1) ATP+DNA ligase(E)→ E-AMP+PPi。 2) E-AMP上的AMP转移到DNA的5′磷酸根上，使其活化，释放出酶。 3) 活化的5′磷酸根与相邻的3′羟基形成3′，5′-磷酸二酯键，并释放出AMP。 * * pGEM?-T Vector DNA 重组 主要有两种： T4噬菌体DNA连接酶。 大肠杆菌DNA连接酶。 DNA连接酶 连接方式： 相同粘性末端的连接 平头末端的连接 粘末端连接法 若DNA插入片段与适当的载体存在同源粘性末端，这将是最方便的克隆途径。同源粘性末端包括相同内切酶产生的粘性末端和不同的内切酶产生的互补粘性末端。相同内切酶产生的粘末端连接得到的重组质粒能够保留接合处的限制酶切位点，因此可以使用原来酶将插入片段从重组体上完整地重新切割下来。而不同酶产生的粘性末端连接得到的重组质粒不能够保留接合处的限制酶切位点，因此不可以使用原来酶将插入片段从重组体上完整地重新切割下来。