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RNA提取方酚毹及原理
RNA提取方法及原理 John 1、研究背景 1.1 RNA研究的重要性 DNA,RNA和蛋白质是三种重要的生物大分子,是生命现象的分子基础。 DNA的遗传信息决定生命的主要性状,而mRNA在信息传递中起很重要的作用。其它两大类RNA,rRNA和tRNA,同样在蛋白质的生物合成中发挥不可替代的重要功能。因此mRNA、rRNA、tRNA在遗传信息由DNA传递到表现生命性状的蛋白质的过程中举足轻重。 1.2 RNA分布 2、方法及原理 2.1 RNA的提取流程 1、样本前处理 2、细胞裂解 3、 RNA的纯化及获得 RNA提取流程-- 样品前处理注意点 RNA提取流程--细胞裂解,以释放RNA 异硫氰酸胍/酚-TRNzol总RNA提取试剂 RNA提取流程-- RNA的纯化及获得 2.2 RNA提取的注意事项 2.2.1 杜绝外源酶的污染 一:严格戴好口罩,手套。 二:实验所涉及的离心管,Tip 头,移液器杆,电泳槽,实验台面等要彻底处理。 三:实验所涉及的试剂/溶液,尤其是水,必须确保 RNase-Free。 2.2.2 阻止内源酶的活性 一:选择合适的匀浆方法。 二:选择合适的裂解液。 三:控制好样品的起始量。 2.3 Rnase 污染的10大来源 1:手指头 2:枪头 3:水/缓冲液 4:实验台面 5:内源 Rnase 6:RNA 样品 7:质粒抽提 8:RNA 保存 9:阳离子 (Ca, Mg) 10:后续实验所用的酶 2.4 几种RNA提取方法 2.4.1 TRIzol法 TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。加入氯仿后离心,样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后,RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后,样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA,在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。 TRIzol法提取流程 1 . 样品处理: (1)培养细胞:收获细胞 1-5×10 7 ,移入 1.5ml 离心管中,加入 1ml Trizol ,混匀,室温静置 5min 。 (2)组织:取 50-100mg 组织(新鲜或 -70 ℃ 及液氮中保存的组织均可)置 1.5ml 离心管中,加入 1ml Trizol 充分匀浆,室温静置5 min 。 2 .加入 0.2ml 氯仿,振荡 15s ,静置 2min 。 3 . 4 ℃ 离心, 12000g × 15min ,取上清。 4 .加入 0.5ml 异丙醇,将管中液体轻轻混匀,室温静置 10min 。 5 . 4 ℃ 离心, 12000g × 10min ,弃上清。 6 .加入 1ml 75% 乙醇,轻轻洗涤沉淀。 4 ℃ , 7500g × 5min ,弃上清。 7.? 晾干,加入适量的 DEPC H 2 O 溶解( 65 ℃ 促溶 10-15min )。 2.4.2 苯酚法 细胞内大部分RNA 均与蛋白质结合在一起,以核蛋白的形式存在。因此,提取RNA时要把RNA与蛋白质分离并除去。将细胞置于含有十二烷基磺酸钠(Sodium dodecyl sulfate,SDS)的缓冲液中,加等体积水饱和酚,通过剧裂振荡,然后离心形成上层水相和下层酚相。核酸溶于水相,被苯酚变性的蛋白质或者溶于酚相,或者在两相界面处形成凝胶层。 苯酚法提取酵母RNA 取1g 活性干酵母在研钵中研碎,加10mL SDS-缓冲液使成匀浆,洗入各Eppendorf管(略少于管容积的一半),加溶菌酶0.1mL,混匀,室温静置10min,再加等体积饱和酚液,室温下剧烈振荡5min。置冰浴中分层,在0-4℃低温环境下,10000r/min 离心10min。吸出上层清液,转入新的Eppendorf 管,加等体积氯仿-异戊醇,室温下剧烈振荡2.5min,然后10000r/min 离心5min。 吸出上层清液,转入另一新Eppendorf 管,加2 倍体积95%乙醇(含2%乙酸钾),在冰浴中放置30min,使RNA 沉淀。再以10 000r/min 离心5min,弃上清液,沉淀用少许无水乙醇和乙醚各洗一次,即加乙醇或乙醚,迅速离心各1min,保留沉淀。倾去乙醚后,减压真空干燥,准确称重,记录。 2.4.3
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