核酸探针标记labelnucleiacidprobe.PPT

第9章 核酸探针标记（label of nuclei acid probe ） 山东大学医学院免疫学研究所 张利宁 一、探针的类型 核酸分子探针是指用放射性核素或其他标记物标记的、能与特定的靶分子发生特异性相互作用的DNA或RNA片段。 1． 基因组DNA探针：病毒DNA等 2． cDNA探针；最常用 3． 寡核苷酸探针：10-50bp，测序、点突变 4． RNA探针：稳定性高、特异性强，但RNA极易降解，不宜操作。 二、探针的标记物 理想的标记物：敏感度高；特异性强；不影响探针分子的主要理化特性；标记、检测方法简单、探针保存时间长；对环境无污染、对人体无损害；价格低廉。 一）放射性标记物 二）非放射性标记物 （一）? 放射性标记物 ----放射性核素 利用放射性核素能产生射线的特性将核素标记在核酸合成所必需的NTP或dNTP上，通过一定方法掺入到DNA 或RNA 中去制成探针，与待测的核酸杂交后，核素产生的?或?射线可使底片感光的特性，通过放射自显影的方法进行检测。 产生?射线的核素：32P、3H、35S 产生?射线的核素：125I 1、常用的放射性核素 1）?32P：产生?射线，灵敏度高，分辨率强，是最常用的放射性标记物，但半衰期短（14。3天）：?位和?位标记。 2）35S：分辨率高、半衰期长（87。1天）。敏感度底 O(S) O(S) O(S) OH- P-O-P-O-P-O-CH2 O 硷基 O O O H H(OH) 2、放射性标记物的优缺点 优点：灵敏度高：0。01pg 特异性强 缺点：放射性污染 成本高、半衰期短，不能长期保存 二）非放射性标记物 1、优缺点 优点：无放射性污染 成本低、操作简单 缺点：敏感性、特异性均低于放射性核 素 2、常用的标记物 1）生物素：1-2pg 生物素化核苷酸：bio-16-dUTP bio-11-dUTP 生物素化核苷酸----通过酶触反应掺入到DNA中去制成探针----杂交----抗生物素蛋白-生物素-酶的复合物—加底物—显色 光敏生物素：生物素与光敏基团结合----光敏生物素-----光敏生物素与核酸探针混合----在强光的作用下----光敏基团与核酸共价结合---生物素标记的 探针 生物素化的核苷酸和光敏生物素 2）地高辛甙元 Dig-dUTP-----通过酶触反应掺入到DNA中去制成探针----杂交----加抗地高辛-酶的复合物—加底物—显色 灵敏度较高：0.1pg 特异性较生物素高 是较理想的非放射性标记物 三、探针的标记方法 （一）缺口翻译法或切口平移法 （二）随机引物法 (三）末端标记法 （四）cDNA探针的标记 （五）RNA探针的标记 （一）缺口翻译法或切口平移（nick translation） 缺口翻译法的原理 限量DNase I在待标记的双连DNA的每一条连上产生若干个单连缺口 利用E.coli DNA多聚酶I的5’-3’外切酶的活性和5‘-3’多聚酶的活性，在缺口处5’末端每切除一个核苷酸，则在3’末端添加一个核苷酸，以修补缺口。 随着缺口在5’末端的移动修饰的核苷酸就掺入到新合成的DNA连中 缺口翻译法的特点 1）快速、简便、标记的探针均一、特异性高 2）仅适用于较长的双连DNA 3）DNA多聚酶必须是E。Coli DNA多聚酶的全酶 4）DNA酶I的浓度一定要适宜 （二）随机引物法（random　priming ) 随机寡核苷酸引物（random primer)：含有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段的混合物，可以与任意核苷酸序列杂交，起到聚合酶反应引物的作用 E。coli DNA聚合酶I的Klenow大片段（仅具有5-3多聚酶的活性，而无外切酶的活性） 随机引物法标记的原理 变性后的探针DNA或RNA与随机引物混合 随机引物按碱基互补的原则与模板DNA 的相应区域结合 DNA多聚酶I的Klenow大片段即从引物3’-OH端开始合成互补DNA连 反应中若加入修饰的dNTP即可获得标记的DNA探针 随机引物法的特点 1）不但可用于双连DNA的标记，而且  可用于单连DNA和RNA的标记 2）操作简单 3）标记率高 (三）末端标记法 末端脱氧核苷酸转移酶法（termi