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培养基制备技术 南华大学预防医学与放射卫生实验教学中心 教学对象：高等医学院校卫生检验专业学生 实验课时：4学时 课程类型：专业实验课 课程要求：必修 每组人数：2人 实验目的和要求 掌握常用培养基制备的基本过程。 熟悉常用培养基的种类及用途。 熟悉高压蒸汽灭菌的使用。 实验内容 常用培养基（液体培养基、半固体培养基及固体培养基）制备。 高压蒸汽灭菌器使用。 一、培养基的种类（按用途分类） 基础培养基 营养培养基 鉴别培养基 选择培养基 增菌培养基 厌氧培养基 培养基的种类（按物理性状分类） 液体培养基： 不含凝固剂，用于增菌和接种纯种细菌。 半固体培养基： 含0.3％～0.5％琼脂。 用于观察细菌动力、保存菌种。 固体培养基：平板、斜面。 含2％～2.5％琼脂。 平板：用于细菌的分离培养。 斜面：用于纯培养、保存菌种。 二、培养基制备的一般程序 二、培养基制备的一般程序 调配：按照培养基配方正确称取各种原料放于搪瓷杯中。另用量筒量取所需蒸馏水量。 溶化：在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解。 加琼脂溶化：加热过程中要不断搅拌，可适当补水。 调pH值：用1N NaOH或1N HCl调至培养基规定的pH值，用pH试纸对照。 二、培养基制备的一般程序 分装加塞：注意不要污染棉塞。塞好棉塞的试管和锥形瓶应盖上厚纸用绳捆札，准备灭菌。 灭菌：不同培养基采取不同灭菌方法。 检定：培养基灭菌后必须在37℃下恒温培养24h，确定无菌生长，方可使用。 保存：一般至4℃保存备用。 分装量的要求 液体培养基 分装量约为试管高度的1/4～1/3，加塞后灭菌直立； 半固体培养基 分装量为试管高度的1/4～1/3，加塞后灭菌趁热直立凝固； 斜面培养基 分装量约为试管高度的1/4～1/3，加塞后灭菌，趁热摆成斜面； 灭菌后斜面摆放 斜面长度约为试管长度的2/3，且下端有1cm柱高； 分装量的要求 琼脂平板： 先将灭菌琼脂融化后冷却至50℃左右，以无菌操作倾注于灭菌平皿内，水平旋转平皿，待琼脂凝固后将平皿翻转，置4℃保存备用。 分装包扎 培养基灭菌 耐热培养基（如普通营养琼脂平板）： 常用高压蒸汽灭菌，条件为103.43kPa，15-20min；含糖培养基以68.95kPa，10-15min； 不耐热培养基：如糖类、明胶和牛乳等。 常用间歇蒸汽灭菌； 富含蛋白质的培养基： 用血清凝固器灭菌； 对含高营养不耐热培养基：如血清,细胞培养液等。 用滤过除菌。 三、高压蒸汽灭菌器的使用 灭菌器内加入适量的水，将包扎好的拟灭菌物品放入其中。 盖好盖子，接通电源，进行加热。 排除高压锅内的冷空气：可将排气阀打开，待排出大气后关闭排气阀；或关闭排气阀，待压力上升到0.5kg/cm2时再打开排气阀，待压力回复到0时再关闭排气阀。 三、高压蒸汽灭菌器的使用 当压力达1.05kg/cm2时，此时灭菌器内的温度为121℃，维持30min。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物时，应适当降低压力，延长时间。 灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能打开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品。 高压蒸汽灭菌器使用注意事项 无菌包不宜过大，不宜过紧，各包裹间要有间隙，使蒸汽能对流易渗透到包裹中央。消毒前，打开贮槽或盒的通气孔，有利于蒸汽流通。而且排气时使蒸汽能迅速排出，以保持物品干燥。消毒灭菌完毕，关闭贮槽或盒的通气孔，以保持物品的无菌状态。 高压蒸汽灭菌器使用注意事项 布类物品应放在金属类物品上，否则蒸汽遇冷凝聚成水珠，使包布受潮。阻碍蒸汽进入包裹中央，严重影响灭菌效果。 定期检查灭菌效果。经高压蒸汽灭菌的无菌包、无菌容器有效期以1周为宜。 * * 调配 溶化 矫正pH 过滤澄清 分装 灭菌 检定 保存