核酸分离纯与化技术.pptVIP

基因诊断技术 基因诊断的特点: 高度的特异性 高度的灵敏性 实现早期快速诊断 被检测基因不一定活化，可检测表达差异基因。 基本技术： （一）核酸分子杂交 （二）聚合酶链反应（PCR） （三）单链构象多态性检测 （四）限制酶酶谱分析 （五）DNA序列测定 （六）DNA芯片技术 第一节 核酸的分离与纯化 意义：实验的第一步工作，实验结果的基本保障 原则： 保证一级结构的完整性 排除其它大分子的污染 一、首先了解核酸的存在状态及分布： 形状：真核生物染色体DNA是双链线状，其细胞器DNA以及原核生物DNA，质粒DNA等都是双链环状。 多数生物体的RNA分子是单链线状。而且，不同类型的RNA还有不同的结构特点。如真核生物mRNA多数有PolyA尾巴。至于病毒、类病毒所含的DNA和RNA分子则形式多样，有双链线状、双链环状、单链线状、单链环状等。无论DNA还是RNA，在体内都形成一定的高级结构。 分布： 真核生物的DNA主要存在于细胞核中，只有约5%在线粒体、叶绿体等细胞器中。RNA则75%左右存在于细胞质中，约15%在细胞器中，约10%在核中。原核生物DNA集中在核质区，RNA分散在细胞质里。细胞质各种RNA中，以rRNA的数量最多（约占5%），tRNA其次（15-20%），mRNA最少（1-5%）。 二．分离纯化核酸时的注意事项 　　要得到具有生物活性的核酸大分子，在分离时必须避免核酸变性，并尽可能保持分子的完整性，避免降解。因此，要注意下列事项： １.尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少变性降解的机会。 ２.减少化学因素对核酸的降解 ３.减少物理因素对核酸的降解 温度： 　　最适温度　４ ℃ 防止机械剪切力的作用： 　基因组DNA：分子细长，容易受到机械剪切力的作用而断裂，所以机械剪切作用是分离DNA时的主要危险。 　 操作时动作必须轻缓，搅拌时要温和， 避免让DNA溶液通过狭窄的孔道 。在提取缓冲液中加入蔗糖或山梨糖醇等增加溶液的渗透压。 提取分子量较小，结构又很紧密的DNA，如小的细菌质粒超螺旋DNA等时，机械剪切力的威胁较小，操作时可不必过于谨慎 ４.防止核酸的生物降解 核酸酶直接破坏核酸一级结构，必须抑制其活性 　对于DNA酶： 　大多数DNA酶作用时需要二价金属离子，如Ca2+, Mg2+等。因此只要加入EDTA（乙二胺四乙酸），螯合剂就可以基本上抑制DNA酶的活力。 　 无所不在的RNA酶： 外源性RNA酶：RNA制备过程中用到的玻璃和塑料制品、研究人员本身尤其是研究人员的手，以及分离过程中用到的试剂和溶液。 内源性RNA酶：组织本身所固有的，在某些组织中（如胰腺），或者在其特定的生理状态（如快速发育期间）下的含量很高。而且一当细胞破碎后即释放出来。 对于RNA酶： 　　其具有高稳定性，抗酸抗碱，具很广的pH作用范围，抗高温严寒（0~65℃均具有活性）。而该酶作用时不需要二价金属离子，故用螯合剂无法抑制其活力。 三．核酸的分离提取 大致步骤： （一）破碎细胞 1．机械破碎法 通过机械运动所产生的剪切力的作用使细胞破碎的方 法，称为机械破碎法。 　2．物理破碎法 　　通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用使组织细胞破碎的方法，称为物理破碎法。物理破碎法多用于微生物细胞的破碎。 常用的物理破碎方法有： ①温度差破碎法：利用温度的突然变化，细胞由于热胀 冷缩的作用而破碎。 该法简单易行，但效率不高，需反复几次才能达到预 期的效果。 ②压力差破碎法：通过压力的突然变化，使细胞破碎。 常用的有高压冲击、突然降压及渗透压变化等方法。 如红血球在纯水中会发生破壁溶血现象。 ③超声波法：超声波是破碎细胞或细胞器的一种有效手 段，且一次处理的量较大。该方法的主要缺陷是超声 空穴局部过热引起的生物大分子的变性，所以超声振 荡处理的时间应尽可能短，容器周围以冰浴冷却处 理，尽量减小热效应引起的酶的失活。 ３.化学破碎法 通过各种化学试剂对细胞膜的作用使细胞破碎的方 法，称为化学破碎法。常用的化学试剂有甲苯、丙 酮、丁醇、氯仿等有机溶剂和Triton，Tween等表 面活性剂。 ４.酶促破碎法 通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细 胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎的目的。 （二）核蛋白的解聚和蛋白质的去除 1．酚抽提法 　　酚和氯仿是蛋白质变性剂，当它们与含核酸和蛋白质的水溶液一起振摇时形