介质环境对辣根过氧化物酶催化荧光反应体系的影晌-上海有机化学研究所.PDFVIP

化学学报 ACTA CHIMICA SINICA 1995，刀， 248-253 介质环境对辣根过氧化物酶催化荧光反应体系的影晌 李庆阁* 赵一兵许金钩黄贤智 陈国珍 (厦门大学化学系 现代分析化学研究所厦门 361005) 摘要 探讨了缓冲溶液、溶剂和表面活性剂对对经基苯丙酸一过氧化氢一辣根过氧化物酶反应体 系反应平衡及产物荧光性质的影响啕表明二聚体荧光产物在溶液中存在酸碱平衡，用荧光滴定法 求得其酸离解常数 pKa毛 8.3.碱式产物的荧光强于酸式碱性环境使酶活性降低吨反应平衡时间 延长.阳离子胶柬澳化十六皖基三甲馁 (CTMAB) 和氯化十六烧基三甲钱 (CTMAC) 对该体系兼 有催化和增敏作用‘据此提出一种更为灵敏的测定辣根过氧化物酶的方法. 关键词 介质环境，辣根过氧化物酶，对挂基苯丙酸，催化荧光反应 辣根过氧化物酶 (HRP) 催化氧化荧光反应在环境检测和生化分析中占有重要地位，广 泛应用于大气和海洋中 H 0 [1 J ，也是提高酶免疫分析灵敏度的荧光酶免疫分析的依 的测定 2 2 据[~J 此外‘活体细胞作用伴随产生的活性氧也常用该反应测定i汀，而且通过与能生成 HP2 的各类反应尤其是氧化酶的催化氧化反应偶联可以间接测定大量的生化物质[4J 目前已经发现并应用于实际测定的 HRP 催化氧化生荧物质已有数种，以对起基苯丙酸 (HPPA) 为代表的对位取代酣类化合物因其灵敏稳定等优点应用最广，但是 pH 不匹配问题 限制了该类物质的应用[5J 由于 HRP 在中性环境中活力最大，荧光产物在强碱中荧光最 强，为获取最.高灵敏度，常需反应和测定分别进行[6J 为探求解决 pH 不匹配问题及进一步提高测定灵敏度的途径‘详细研究了缓冲溶液.有 HRP 机洛剂及表面活性剂对 HPPA-H、02- 反应平衡和产物荧光性质的影响及规律句最后 pH 不匹配问题的方法及更灵敏地测定 HRP 的方式. 提出一种克服 1 实验 1.1 仪器 Shimadzu RF-5000 荧光分光光度计. 1. 2 试剂 HRP(EC 1.11.1.7, RZ=3.0嘈2501U / mg) 购自北京华美生物工程公司. HPPA (保 证试剂)和对是基苯乙酸 (HPAA) (保证试剂)购自上海东京化成寄售部.高香草酸 (HVA) (生化试剂)系 Merck 产品. HP2 (A. R. 30%) 系上海桃浦化工厂产品.有机溶剂及试剂为市 售分析纯，表面活性剂及卢一环糊精(卢-CD) 为市售化学纯.实验用水为石英亚沸蒸锢的二 次去离子水. 1993 年8 月 5 日收到修改稿于1993年12月 20 日收到 化学学报 ACTA CHIMICA SINICA 19时 • 249 1.3 实验方法 1.3.1 缓冲溶液的影响 于 I-cm 情塞石英液、池中‘依次加入缓冲市被 2.6mL， 0.725IU / mL HRP 50p L. 7.5mmol L-1 HPPA 200p L. 0.03% HP2 100μL.上 F摇匀，按选定的最 大激发.发射搜长().口/ ì. ) 记录荧光动力学曲线 (F-r)‘并测定平衡后j容模的激发、发射 en jtj i首. 1. 3.2 溶剂的影响 以 0.1 mol L-1 Tris-HCl (pH 7.4)为缓冲溶液，按上述方法得到平衡 后的反应施，取反应液 1.0mL 与 1.0mL 恪剂泪匀鸣测定激发、发射光谱. I. :U 表面活性剂的影响 取 200pL 表面洁性刑1容液(浓度见表 2) 与 2.4mL 0.1 mol L一I Tris-HCl (pH 7 .4)缓冲洁液自合、按同样方法记录 F-t 曲线及平衡液的激发、发射