基因组测序ppt.ppt

技术路线与要求 链终止法对DNA多聚酶的要求 测序的DNA多聚酶 将DNA克隆到M13噬菌体载体 将DNA克隆到噬粒 PCR产生单链DNA 引物决定模板链的测序起点 技术路线 自动化测序原理 DNA芯片测序 第三代DNA测序技术新突破——单分子DNA纳米孔测序技术 来自美国华盛顿大学等处的研究人员利用纳米生物学技术获得了新一代测序技术的突破，这种新方法能为癌症、糖尿病或某些成瘾患者量身绘制个性化基因测序蓝图，提供更加高效的个体医疗。这一研究成果公布在PNAS杂志上。 领导这一研究的是华盛顿大学的Jens H.Gundlach，其它研究人员包括：Ian Derrington, Tom Butler, Elizabeth Manrao 和Marcus Collins等人。 接二连三的个人基因组图谱绘制陆续完成，说明了第二代测序技术的强大力量，但是第二代测序技术很快就遇上了强劲的对手——第三代测序技术，也就是被称为下下一代的测序（next-next-generation sequencing）的直接测序方法。这一测序技术是基于纳米孔（nanopore）的单分子读取技术，不同于之前的两代技术（需要荧光或者化学发光物质的协助下, 通过读取DNA聚合酶或DNA连接酶将碱基连接到DNA链上过程中释放出的光学信号而间接确定的），可以直接读取序列信息，简洁快速。 第一代测序技术是双脱氧链末端终止法——根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生A，T，C，G四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得DNA序列。第二代测序技术是焦磷酸测序法——由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，适于对已知的短序列的测序分析。而第三代测序技术则是基于纳米孔的单分子读取技术，这种方法读取数据更快、有望大大降低测序成本，改变个人医疗的前景。这一技术的研发是系统工程，涉及生物、半导体、计算机、化学、光学等多个领域，需要不同学科顶尖力量的合作。 在这篇文章中，研究人员设计了一种可以在纳米孔内对DNA进行快速测序的新方法，这种纳米微孔只有1个纳米大小，仅够用来测量一个DNA的单分子链。研究人员把微孔放在一层浸泡在氯化钾溶液中的膜上，并施加一个小的电压，让电流通过微孔。不同的核苷酸通过纳米微孔时，回路中的电流就会随之改变，这些电流称为特征信号。胞核嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤和胸腺嘧啶这些DNA的基本组成要素，会生成不同的特征信号。 研究人员利用耻垢分枝杆菌porin A（Mycobacterium smegmatis porin A.）的纳米孔创建一个DNA电子阅读器，这种方法可在极小尺度上对DNA进行测序，并且测序速度更快、相对更加便宜。他们的实验表明，这一方法具有对卫生保健产生广泛影响的潜力。 下一代DNA测序技术也许能获得飞跃性的发展，改变电极间距离从纳米至微米变化，可对病毒及过敏原等各种尺寸的分子粒子进行超高感度、超高速度检测。当然目前第三代基因测序技术竞争也很激烈，美国宣称要在2012年推出成熟的第三代基因测序仪，日本和欧洲也有相关的研发计划。我国也有这方面的计划，中科院北京基因组研究所是国内权威的基因组学研究机构，他们已和浪潮集团成立了“中科院北京基因组研究所—浪潮基因组科学联合实验室”，这一实验室将研发国产第三代基因测序仪，第一台样机预计2013年问世 鸟枪法顺序组装流程 用于测序的流感嗜血杆菌基因组文库 间 隙 的 类 型 间隙的缝合 顺序间隙缝合 流感嗜血杆菌基因组测序结果 限定测序与序列组装 两种策略的比较 浏览测序（sequence skimming) 人类基因组测序结果 人类基因组研究的惊人发现 单核苷酸多态性 人类基因组计划的意义 后人类基因组计划 本章小节 2kb clones 10kb clones 10kb clones 5kb 重复序列 10kb克隆可以作为2kb克隆的支架 10kb克隆可以校正5kb重复序列产生的差错 鸟枪法策略 指导测序策略 不需背景信息 构建克隆群 (遗传、物理图谱) 时间短 需要几年的时间 需要大型计算机 得到的是草图(Draft) 得到精细图谱 两种策略的比较 §4 基因组测序 §4.3基因组测序的其他路线 重要区域的优先测序 人们对感兴趣的基因或与疾病相关的基因优先测序。 如：人类主要组织相容性复合区位于第6号染色体，与人类免疫系统有关，因而优先测序。 EST (Expressed sequen