实时荧光定量PCR技术原理应用及实践（PPT 69页）.ppt

用我们的产品发表的部分SCI文章 a-Bisabolol induces dose-and time-dependent apoptosis in HepG2 cells via a Fas-and mitochondrial-related pathway,involves p53 and NFkB State Key Laboratory of Virology, College of Life Sciences, Wuhan University, Wuhan 430072, China CCR4-NOT Deadenylates mRNA Associated with RNA-Induced Silencing Complexes in Human Cells State Key Laboratory of Molecular Biology and Cell Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China Coadministration of huperzine A and ligustrazine phosphate effectively reverses scopolamine-induce damnesia in rats School of Pharmacy, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, PRChina Effects of Microgravity Modeled by Large Gradient High Magnetic Field on the Osteogenic Initiation of Human Mesenchymal Stem Cells CCR4-NOT deadenylates RISC-associated mRNA in human cells State Key Laboratory of Molecular Biology, Institute of Biochemistry and Cell Biology Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Science shanghai,china Real time PCR--起点检测： -- 起点量是样本中起始的DNA量 -- “加入了500个拷贝” -- 具有重现性，误差小 传统PCR--终点检测： -- 终点产物量经过PCR放大的DNA量 -- “生成了500，0000，0000个拷贝” -- 不恒定，误差大 Real-time qPCR 标准曲线分析 SYBR Green I 工作原理 SYBR Green I 优点： 使用方便，成本低 -- 仅需设计两个引物 通用性好 -- 对DNA模板没有选择性 融解曲线分析 Taqman 工作原理 探针与靶序列配对 （一段序列，两个基团，5’ 报告基团、3’淬灭基团） 完整的探针，报告基团R发射的荧光被淬灭基团Q淬灭， 没有荧光产生。 聚合酶的5’外切酶活性 报告基团R与淬灭基团Q分离，发射荧光。 Taqman 工作原理 SYBR Green I与Taqman 对比 Taqman 特异性高 -- 与特异靶序列结合 对模板有选择性 -- 可进行多重PCR反应 荧光定量PCR解析方法 绝对定量 样本中核酸的量（拷贝数、微克） -- 检测某给定血液样本中的病毒颗粒数，有6000个拷贝 相对定量 不同样本中目的基因表达量的差异 -- 肿瘤组织和正常组织相比 某个基因的表达量mRNA改变了多少倍，改变了60倍 相对定量 相对定量举例 荧光定量PCR体系 Master mix 使用Master mix有效降低系统误差 -- 热启动酶 Hotstar 化学修饰，低温下酶活抑制性强，热复活需10min Fast Hotstar 抗体修饰，热复活仅需几十秒 -- Buffer 反应增强剂 减少模板二级结构影响 控制Mg2+浓度 稳定剂 -- Dye Real SYBRGreen mix RealSuper m