禽流感H7N9血凝和血凝抑制试验培训课件.pptVIP

HI试验原理 红细胞 抗原 凝集抑制反应 抗体 血凝抑制 HI试验原理 红细胞 抗原 不抑制 不抑制 “ ” “ ” 禽流感H7血凝与血凝抑制试验 检测的目的（与H7N9的关系） H7抗体检测为阴性（－）→ 无H7抗体（也就无H7N9抗体) H7抗体检测为阳性（＋）→ 分子生物学方法进行病原检测 H7-Ab-HI试验方法 同H5检测方法，附后。 （GB/T 18936-2003） H7-Ab-HI阴阳性判定标准 HI效价≥4，判定为阳性（＋） HI效价＜4，判定为阴性（－） 质量控制（抗原及标准阴阳性对照） 4U抗原 试剂相关信息 抗原-20℃冷冻保存 血球4℃冷藏保存 生理盐水需要调整PH值到7.2-7.4 配制好的4U抗原若当天不能用完，需冷冻保存，若量大可分装冷冻保存，再次使用融化即可（冻融可能会影响效价，每次使用需测4U抗原HA价） 效价判定 非特异凝集 ND-HI H7-HI 血凝板竖起后观察 非特异凝集 H7-HI 阿氏（Alsevers）液的配制： 试剂 用量（g） 葡萄糖 2.05 柠檬酸钠 0.8 柠檬酸 0.055 氯化钠 0.42 加蒸馏水至100mL，散热溶解后，调PH=6.1 69kPa 15min高压灭菌，4℃保存备用。 附录：血凝与血凝抑制试验 1、试验准备 1%鸡红细胞悬液的配制： 采集至少3只SPF公鸡（非免疫的公鸡）或无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡的血液与等体积阿氏液混合（4℃可保存7天左右）。配制前用PH 7.2的生理盐水洗涤3次每次均以离心机上1500-2000r/min (不得超过2000r/min，否则会导致红细胞破裂，引起溶血)，离心10分钟左右。洗涤后，吸取沉积于管底的红细胞泥1mL，混合于99mL生理盐水中混匀。即得1%RBC。4℃可保存3天左右，若出现溶血应重新采血，重新配制。 4单位抗原的配制 根据血凝试验测新城疫病毒抗原的血凝效价。如测得病毒原液HA=27 ，即27 =128，则配制4单位抗原需将病毒原液稀释128÷4=32倍 那么如果需要32mL 4单位抗原，需要（32÷32=1）mL病毒原液和（32-1=31）mL生理盐水。 血清中非特异性凝集素的去除： 鸡和火鸡血清极少出现非特异性抑制或凝集反应，可不进行处理直接进行试验，其他禽类及哺乳动物血清需进行预处理。 处理方法：56℃水浴30分钟灭活、RDE（受体破坏酶）处理、红细胞吸附、胰酶处理等。 血凝试验 试验过程 PBS也可用PH 7.0-7.2的生理盐水代替（下同） 附录：血凝与血凝抑制试验 2、血凝试验 血凝试验 结果判定 血凝抑制试验 试验过程 附录：血凝与血凝抑制试验 3、血凝抑制试验 HI注意事项 每次试验需做1份标准阴阳性血清的对照，对照成立方可判定试验结果。 阴性血清滴度不应超过2log2 阳性血清滴度应与标定的滴度相差不超过1个稀释度。 每次进行HI试验必须做4U抗原的反滴定，即测一下4U抗原的HA价是否准确。 如果HA价高1滴度（实际为8U），则HI价＋1 如果HA价低1滴度（实际为2U），则HI价―1 血凝抑制试验 结果判定 Hemagglutinin, HA H1~H15 Neuraminidase, NA N1~N9 附录：血凝与血凝抑制试验 4、试验原理 HA试验原理 病毒表面血凝素与鸡红细胞表面糖蛋白受体发生结合而发生凝集 检测病毒的存在，滴定病毒的血凝效价，大致估计病毒颗粒的数量 （1个血凝单位＝106病毒颗粒） 凝 集 红细胞 抗原 凝集反应 HA试验原理 红细胞 不凝集 不凝集 HA试验原理 “ ” “ ”