一种快速高效似的人类淋巴母细胞建株方法 A Rapid and High-effective Method for Establishing Hum.pdfVIP

遗传 HEREDITf1S(Beijing)17(2):34-361995 ·实验技术与方法 · 一种快速高效的人类淋巴母细胞建株方法① 戴和平 夏家辉 潘 乾 龙志高 李麓芸 湖（南医科大学医学遗传学国家重点实验室，长沙410078) ARapidandHigh-effectiveMethodforEstablishing HumanLymphoblastoidCellLines DaiHeping XiaJiahuiPan Qian LongZhigao LiLuyun (TheStateKeyLaboratoryofMedicalGeneticsofChina,HunanMed.Univ.,Changsha410078) 遗传多样性及其资源保存的研究，是全球性生物多样性研究的重要组成部分。人类突变细胞 的保存，不但是研究人类生物学特征的资源，也是在细胞和分子水平上开展遗传病基础研究的材 料．本文应用浓缩的EBV (Epstein-BarrVirus）液转化外周血B淋巴细胞，同时加入环袍霉素 (Cyclosporine)抑制T淋巴细胞 ”〔，整个建株过程不需C02孵育箱，建株成功时间在20天左 右，且成功率达95-100 ，为人类突变细胞的收集、永久保存及其在基因定位、基因克隆等方 面的应用创造了条件。 1材 料 和 方 法 1.1试剂的制备 1.1.1200mmo1/L的谷氨酞胺 G（lutamine）的配制 称取 5.864g谷氨酞胺 分（子量 146.15)，用双蒸水配制成 200ml，高压灭菌，每 loom]培养基中加 0.5ml，即最终浓度为 lmmol／L, 1.1.2淋巴细胞分离液 l（ymphocyteisolation，产地：Pharmacia） 分装成4ml／瓶避（光）， 用前在37℃水浴中加温。 1.1.3培养基 1640：血清 (3（：1)，内含谷氨酸胺，用8%NaHC03调pH至7.21。 1.1.4环抱霉素 c（yclosporine，产地：SAND02PHARMALTD,Basle,Switzerland)5m1 (250mg)／瓶，配制：母液为50mg/ml，取母液20u1，加1640至5m1,即为0.2ug/u]，使用 时取loin加至lml培养基中，最终浓度2ug/ml, 1.1.5EBV制备 培养 B95-8marmoset逐步增加培养液至250m],最后一次换液后的6-7 天开始分离EBV，即3000fpm离心15，将上清液转至另一离心管41,4℃下10000rpm离心 ①本文为国家自然科学基金资助项目． 2期 戴和平等：一种快速高效的人类淋巴母细胞建株方法 35 2.5小时，弃去99％的上清液，留下2.5m1，将EBV沉淀物混匀，再用loml的离心管3OOOrpm 离心15，将上清液用0.45um的细菌漏斗过滤后分装成100川／管，-70℃保存。 1.1.6二甲基亚矾 由imethylSulfoxide,(CH3)2SO，分子量78.13]，进口分装。 1.2建 株 取外周血 1-2rr.1，肝素抗凝 室（温存放0-24h)，将全血与2ml1640(pH7.21）在离心管 中混合，将上述混合血沿管壁慢速注人到含有 1-2ml淋巴细胞分离液的离心管中，静置30， 1500rpm离心15，离心后可见分为4层，然后用尖吸管吸取白细胞层 即（第二层），注入离 心管，取5m1的1640(pH7.2士），注入含有白细胞的离心管中，轻轻混匀，进行第一次洗涤， 1500rpm离心15，吸去上清液，加5ml1640进行第二次洗涤，离心1500rpm15，吸去上 清液，将白细胞接种于含有1ml1640培养基的试管中，然后加人环抱霉素 (2（,ug/mi)和100ul 的EBV液混匀，以每分钟40次的速度，置水浴摇床 3（7C1）摇3小时，1500rpm离心15， 吸去上清液，将细胞接种于含有lml培养基 1（640：胎牛血清3：1)的试管中，然后加环抱霉 素 (t（ug/ml)轻轻混匀，置37℃细胞培养箱。7天左右开始观察，视细胞转化和聚集状况及培 养液pH的改变，进行半量换液，并维持环抱霉素的浓度。待转化的淋巴细胞明显增多，并且指 弹见细胞成团，同时在显微镜下观