动物细胞血似涂片的制备.docxVIP

动物细胞血涂片的制备、瑞氏染液及细胞观察实验目的学习涂片制备的一般方法学习瑞氏染色的方法学习辨认各种血细胞二、实验原理血涂片的简介血涂片的显微检查是血液细胞学检查的基本方法，临床上应用极广泛，特别是对于各血液病的诊断具有重要的价值。血涂片制备时手工推片法用血量少、操作简单，是最广泛应用的方法。血涂片制备是血液学检查的重要基本技术之一。一张良好的血片，厚薄要适宜，头体尾要明显，细胞分布要均匀，膜的边缘要整齐，并留有一定的空隙。血涂片的制备及瑞氏染液的配制用推片法将血液制成薄的血涂片，使血细胞成单层排列。瑞氏染料是由碱性染料天青（ Methvlem blue ）和酸性染料伊红（ Eostm Y ）合称伊红天青 染料即瑞氏 （天青－伊红Y）染料 。甲醇作瑞氏染料溶剂，即成瑞氏染液。（注：甲醇具有强大的脱水力，可将细胞固定在一定形态及增加细胞结构的表面积，提高细胞对染料吸收作用，同时由于甲醇吸附染色液中的水，使染色液升温，加速染色反应。）细胞染色的原理细胞的染色既有物理的吸附作用，又有化学的亲和作用，各种细胞成分化学性质不同，对各种染料的亲和力也不一样。因此，在同一血片上，可以看到各种不同的色彩。例如：嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结果，染粉红色，称为嗜酸性物质；细胞核蛋白为酸性，与碱性染料天青结合，染紫蓝色，称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态与伊红和天青均不易结合，染淡紫色，称为中性物质。哺乳动物各类血细胞特点红细胞：圆饼状无核，中间薄，周围厚；数量最多。淋巴细胞：基本为圆形，比红细胞稍大；核几乎占据整个细胞，一侧常有小凹陷，染色呈很深的紫色；胞质很少，仅在细胞核外有一薄圈，几乎无色。单核细胞：最大、少、胞体为圆形或椭圆形；胞核形态多样，有卵圆形、肾形、马蹄形等，常偏位，着色比淋巴细胞核浅；核质比小于淋巴细胞。嗜中性粒细胞：基本为圆形，比红细胞和淋巴细胞大，但比单核细胞小；核长，为腊肠状或分叶状（2-5叶），经常很难分辨。嗜酸性粒细胞：胞体为圆形，有一个大而染成淡紫色的核；胞质充满粗大的嗜酸性颗粒（红色）；由于核占据了细胞的很大一部分，使颗粒在整个细胞内的分布并不均匀。嗜碱性粒细胞：细胞呈圆形，胞质内有大量小的嗜碱性颗粒，呈蓝紫色，分布于整个细胞，覆盖核。血小板：最小，多角形聚集成群。牛蛙各类血细胞特点红细胞：椭圆形，有核，最大。淋巴细胞：特征同哺乳动物的淋巴细胞，但是为血细胞中最小的一种。单核细胞：细胞形态不规则；核偏位，占整个细胞的1/2-2/3。嗜酸性粒细胞：细胞呈圆形或卵圆形，大小差别比较大，有的比红细胞还大，有的与其他两种粒细胞大小接近；核很大，位于细胞中央或一侧，呈肾形或卵圆形，也有分叶状、环状，染色为淡紫红色；胞浆充满红色圆形颗粒，排列紧密。嗜碱性粒细胞：数量极少，细胞为圆形；胞质中充满蓝色或深紫色圆形颗粒，颗粒大小不一，常掩盖核。嗜中性粒细胞：细胞为圆形或卵圆形；核偏位，形状不规则，具有多样性，有肾形、带状、弯月状或分成两叶至多叶，胞核染色为紫红色；胞质着色较浅，其中有淡蓝色颗粒状物质不均匀地分布在胞质内，有时颗粒状物质不十分明显。实验材料及试剂材料新鲜采集的牛蛙血（采集时加入肝素钠溶液抗凝）。（由老师完成）试剂肝素钠溶液：用生理盐水配成180IU/mL。（由老师配制）瑞氏染液：瑞氏染料粉末0.1g和甲醇60mL。配法：把染料放在研钵内，加入少量甲醇研磨，使染料溶解，然后把溶解的染料倒入干净的棕色的玻璃瓶当中，并至用完甲醇为止。（由老师配制）pH6.4的PBS：磷酸二氢钾（无水）0.3g，磷酸二氢钠（无水）0.2g，加入少量蒸馏水溶解并定容至1000mL。（由老师配制）用品普通光学显微镜、酒精棉、蜡笔、载玻片等。四、实验步骤流程：清洁－加样－推片－干片－选区－染色－洗片a)清洁载玻片：载玻片在使用之前用酒精棉清洁晾干。b)加样：在干净的载玻片长轴一端离边缘约1cm处的中央用胶头滴管滴1/5滴血。取另一张干净的载玻片作为推片，让推片的一端先出于血滴推片方向的前侧，并与血滴玻片成35～45夹角。c)推片：先将推片向后拉至血滴处，待血液沿着两块载玻片接触线向两边扩散后，将推片保持夹角，向血玻片左侧均速推进，血液随推片而行，在血玻片上形成一层血膜，即为血涂片d)干片：推好的血涂片在空气中晃动，使其迅速干燥。e)选区：在显微镜下观察，寻找涂片中均匀分散良好的血膜，用蜡笔在四周画线（多画几圈），作为提防。f)染色：滴加适量的瑞氏染液覆盖选定区域，染1分钟；在滴加等量的PH6.4的PBS缓冲液稀释染液，轻摇混匀，液面浮现一层金黄色金属物质，然后静置染色15-20min。g)洗去多余染液：用流水或滴加蒸馏水直接洗去浮液。（不要先将染液倒掉）将载玻片自然晾干，用于观察。h)观察辨认各种细胞。五、实验结果a)上图中的1框内的细胞