山羊睾丸支持细胞的分离培养及鉴定.PDFVIP

2014年第50卷第21期 and ReproductionPhysioIogy·繁强生理 山羊睾丸支持细胞的分离培养及鉴定 姜 颖，潘庆杰’，张钦恺，李 岩，徐君君 (青岛农业大学动物生殖发育与基因工程研究所，山东青岛266109) 摘 要：本实验通过改良方法使山羊睾丸支持细胞能够在体外快速分离且较长时间培养。将山羊睾丸组织剪 第消化。利用差速贴壁法纯化细胞悬液中的支持细胞．对培养72h的细胞经台盼蓝染色鉴定细胞活率，观察支 持细胞形态学特征及生长增殖情况，油红0染色、H．E．染色及福尔根染色对支持细胞进行鉴定。结果表明：染色 结果观察到在细胞核周围有空泡状结构且有核小体存在．表明本实验分离培养的是山羊睾丸支持细胞，且纯 度较高，充分证明了该改良方法可有效的分离山羊睾丸支持细胞并在体外较长时间培养。 关键词：睾丸；支持细胞；分离；体外培养；山羊 中图分类号：S827．3 文献标识码：A 文章编号：0258—7033(2014)21埘023—04 睾丸支持细胞，又称足细胞、次细胞，由sertoli… 1材料与方法 发现，因此又称Senoli细胞。在曲细精管中，支持细胞 1．1 h 为精子的发生提供结构性支撑及稳定的壁龛。许多 材料实验动物3月龄崂山奶山羊禁食12一14 研究认为支持细胞能够分泌多种因子【2】，为睾丸中 后颈部放血处死，无菌条件下取一侧睾丸(带阴囊)， 精子的形成提供营养13J，因此对支持细胞体外培养 酒精消毒后放入37cc含双抗的无菌PBs中，l一2h内带 的研究成为探究雄性生殖细胞的基础。 回实验室用于细胞分离培养。 支持细胞是目前克服移植免疫排斥反应最具希 主要试剂、溶液F12，DMEM培养基、丙酮酸钠、非 望的细胞川；支持细胞能够作为饲养层与干细胞体 必需氨基酸、胎牛血清、台盼蓝染液、胰蛋白酶、青 外共培养㈣；支持细胞为糖尿病和帕金森病的治疗 链霉素溶液(Hvclone)，胶原酶IV、透明质酸酶、油红 提供了新思路嘲；有研究表明，睾丸支持细胞在体细 胞动物克隆方面的可能性17J。可见支持细胞体外分 Feulgen染液(百浩生物科技) 离培养在生物学研究领域具有重要作用且应用前景 1．2方法 广阔。杨润军等【8l通过改良国外方法得到原代小鼠 1．2．1 山羊睾丸支持细胞的分离与纯化3月龄崂 支持细胞，之后又有研究报道了小鼠支持细胞的体 山奶山羊禁食12～14h后颈部放血处死，无菌条件下 外分离培养㈨“。刘闯等【12j分离了新生牛睾丸支持细 取一侧睾丸(带阴囊)，酒精消毒后放入37℃含双抗 的无菌PBs中，1～2h内带回无菌室，剪除阴囊和鞘 胞。随后，郑鹏等【131和孙秀娟等【141又报道了犊牛支持 细胞的分离培养，但是以山羊作为实验动物研究 膜，放人酒精中浸泡数秒，无菌PBS清洗3—5次，除去 支持细胞的报道几乎没有。本实验以文献报道的 白膜，剪取1～2g睾丸实质，用眼科剪去除可见的血 睾丸支持细胞培养方法为基础，改进消化液的组 合、消化时间及纯化方法，有效分离且较长期培养 后将组织块剪碎至l一2mm3小块，移人50mL离心 山羊睾丸支持细胞，为进一步探究和利用支持细 管，加入5倍体积的4mg，mL胶原酶IV与O．2％透明质 胞奠定基础。 酸酶混合消化液，37℃消化30min离散曲细精管，加 入F12／DMEM培养基冲洗后1200影min离心5min，重 收稿日期：2014—05—13；修回日期：2014—06—24