土壤过氧化氢酶、过氧化物酶、磷酸酶、蔗糖酶、脲酶测定方法.docVIP

土壤酶活性测定方法 土壤脲酶的测定方法 脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和。土壤脲酶活性与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。 土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法。1）甲苯 2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。 3）PH6.7柠檬酸盐缓冲液：184柠檬酸和147.5氢氧化钾溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释至1000。 4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5苯酚溶于少量乙醇，加2甲醇和18.5丙酮，用乙醇稀释至100（A），存于冰箱中；27NaOH溶于100水（B）。将AB溶液保存在冰箱中。使用前将液各20混合，用蒸馏水稀释至100。 5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。 6）氮的标准溶液： 精确称取0.4717硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有0.1mg氮的标准液称取5g以等体积的水代替基质，其他操作与样品实验相同。整个实验设置一个对照不加土样，其他操作与样品实验相同以检验试剂纯度以24小时后土壤中NH3－N的毫克数表示土壤脲酶活性。NH3－NNH3－N毫克数NH3－N毫克数NH3－N毫克数Na.3H2O溶至1L。或者取14.8ml 0.2mol/L 醋酸溶液和35.2ml 0.2mol/L 醋酸钠溶液稀释至1L. b. 柠檬酸盐缓冲液 PH 7.0 0.1mol/L 柠檬酸溶液： 19.2g C6H7O8溶至1L. 0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液 ： 53.63g Na2HPO4.7H2O或者71.7g Na2HPO4.12H2O溶至1L. 取6.4ml 0.1mol/L 柠檬酸溶液加43.6ml 0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液稀释至100ml. c. 硼酸盐缓冲液 PH 9.6 0.05mol/L 硼砂溶液 19.05g 硼砂溶至1L. 0.2mol/L NaOH溶液 8g NaOH溶至1L. 取50ml 0.05mol/L 硼砂溶液加23ml 0.2mol/L NaOH溶液稀释至200ml. 2）0.5% 磷酸苯二钠（用缓冲液配制） 3）氯代二溴对苯醌亚胺试剂：称取0.125g氯代二溴对苯醌亚胺，用10ml 95%乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用。 4）甲苯 5）0.3%硫酸铝溶液 6）酚标准溶液 酚原液：取1g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至1L，存于棕色瓶中。 酚工作液（0.01mg/ml）：取10ml酚原液稀释至1L。 7）PH9.4硼酸缓冲液 0.2 mol/L硼酸：12.37g硼酸加水溶解稀释至1000ml 0.05 mol/L硼砂：19.07g硼砂加水溶解稀释至1000ml 取800ml硼砂溶液加200ml硼酸溶液混合即为PH9.4硼酸缓冲液。 三、操作步骤 标准曲线绘制：取0、1、3、5、7、9、11、13ml酚工作液，置于50ml容量瓶中，每瓶加入5ml PH9.4硼酸缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度。30min后，在分光光度计上660nm处比色。以显色液中酚浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。 称2g土样置于200ml三角瓶中，加5滴甲苯，轻摇15min后，加入20ml 0.5%磷酸苯二钠（酸性磷酸酶用乙酸盐缓冲液；中性磷酸酶用柠檬酸盐缓冲液；碱性磷酸酶用硼酸盐缓冲液），仔细摇匀后放入恒温箱，37℃下培养24h。然后在培养液加入40ml 0.3%硫酸铝溶液并过滤。吸取3ml滤液于50ml容量瓶中，然后按绘制标准曲线方法显色。用硼酸缓冲液时，呈现蓝色，于分光光度计上660nm处比色。 注意事项: 1、每一个样品应该做一个无基质对照，以等体积的水代替基质，其他操作与样品实验相同。整个实验设置一个对照不加土样，其他操作与样品实验相同以检验试剂纯度毫克数毫克数毫克数3,5- 二硝基水杨酸比色法蔗糖酶酶解所生成的还原糖与?3,5- 二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。颜色深度与还原糖量相关，因而可用测定还原糖量来表示蔗糖酶的活性。 %蔗糖 4）3,5- 二硝基水杨酸试剂（DNS试剂） 预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。准确称取葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至mL容量瓶中，定容，摇匀冰箱中4℃保存期约一星期若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。标准曲线绘制分别吸0、0.、0.、0.、0.、mL于试管