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谢谢各位光临！敬请各位指出不足并多提建议 * 回顾 * 二 时间分辨荧光技术 广州市源起生物科技有限公司 培　　　训 主要内容 时间分辨荧光免疫技术（TRF）定义。 TRF的标记物及特点。 为什么叫“时间分辨”? TRF在免疫分析方法学中的地位。 各种免疫方法学的比较。 临床应用 回顾标记免疫学发展 放射免疫 （精度：10-12mol/L ） 酶联免疫 （精度：10-9 mol/L ） 胶体金标记 （金标：10-15mol/L ） 化学发光 （精度：10-15mol/L ） 电化学发光 （精度：10-17mol/L ） 时间分辨荧光（精度：10-18mol/L ） 生物芯片 时间分辨荧光技术  （Time-Resolved Fluorescence） 时间分辨荧光免疫分析 （TRFIA） 时间分辨免疫荧光分析（TRIFMA） 时间分辨荧光核酸探针分析 时间分辨荧光细胞活性分析 时间分辨荧光探针分析 时间分辨荧光技术原理 （TRF） 用三价稀土离子及其螯合物作为示踪物，代替荧光物质、同位素、酶和化学发光物质，标记抗原、抗体、激素、核酸探针等物质； 当免疫反应发生后，根据稀土离子螯合物的荧光光谱的特点 （特异性强、荧光光谱的Stokes位移、寿命长），用时间分辨荧光分析仪，测定免疫反应最后产物的荧光强度。 根据荧光强度和相对荧光强度比值，判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的。 时间分辨荧光免疫原理图 （Time-resolved Fluorescence Immunoassay） 时间分辨荧光免疫试剂工作原理示意图 V 标 记 物 轻链 螯合剂 Eu 重链 V V 标记物为具有独特荧光特性的稀土金属---镧系元素 镧系元素共有15种，应用在时间分辨荧光免疫技术中有四种： 铕(Eu)、钐（Sm)、镝(Dy)、锝(Te) 镧系元素荧光特点： 荧光寿命极长 镧系元素螯合物（60~900 us) 铕：714us 普通荧光免疫中荧光团：1~100us 样本中蛋白质荧光：1~10us，易猝灭。 Stokes位移大（大约290nm） 铕：发射光613nm、激发光340nm， 荧光素的Stokes位移为28nm 荧光特异性强。（发射光谱带很窄：615± 5nm） 解离-增强技术可使其荧光性提高100万倍 利用镧系元素荧光物理特性，荧光激发后在固定时间段检测特异性荧光而在此时间之前，非特异性荧光已完全衰减为0 时间分辨荧光免疫原理图 利用镧系元素光谱特点，将发射荧光与激发荧光分辨开来，零本底的又一保障 发射光谱与激发光谱间存在的巨大Stokes位移。可以通过干涉滤光片将发射光谱与激发光谱完全分离。 DELFIA技术为临床检测带来的先进性 技术 特点 检验先进性 时间分辨 光谱分辨 特异性荧光与非特异性荧光分离 发射荧光与激发荧光分离 零背景、高特异性 解离-增强 荧光性大大提高 稳定的荧光螯合物 线性范围更宽 重复性更好 原子标记 标记位点多，可达20个 对标记物结构及活性影响小 无衰变 受环境影响小 高稳定性，高精确度 试剂保质期至少一年 标准曲线保留时间长 同一批次只需两点定标 多标记 单，双，三，四标记 同一试剂盒可同时测多个项目 灵敏度更高，检测范围更广 以下数据均出自于各制造厂家自己的产品说明书 试剂 DELFIA Immulite ACS-180 AFP 0.1-1000IU/ml 0.2-300IU/ml 1.0-1000IU/ml CEA 0.1-500ng/ml 0.2-500ng/ml 0.5-100ng/ml HCG 0.5-10000U/L 5-5000U/L 2-1000U/L TSH 0.005-100μU/ml 0.002-75μU/ml 0.03-150μU/ml FSH 0.05-256mU/ml 0.1-170mU/ml 0.3-200mU/ml Prog 0.08-120nmol/L 无 0.1-40ng/ml Prolactin 0.04-250ng/ml 0.5-150ng/ml 0.3-200ng/ml 　 时间分辨荧光免疫检测的标准曲线相当稳定， 同一批次的试剂盒可用两点法加批次的参考曲线定标 0.5 1 2 5 10 20 50