LAMP技术在肺炎衣原体检测中应用-呼吸内科专业毕业论文.pdfVIP

目录 目 录 第 1 章 引言 1 第 2 章 材料与方法 2 2.1 主要实验仪器和器材 2 2.2 主要试剂 2 2.3 检测病原菌的确定 2 2.4 实验对象 2 2.5 诊断标准 3 2.6 统计学处理3 2.7 实验步骤 3 2.7.1 设计特异性引物 3 2.7.2 配制 LAMP 反应溶液（25ul 体系），见表2 。4 2.7.3 配制引物混合物 4 2.7.4LAMP 扩增反应及反应产物的检测 4 2.7.5 结果分析 5 2.7.6 特异性检测 5 2.7.7 敏感度检测 5 2.7.8 确定研究对象，收集研究标本 5 2.7.9 痰常规细菌培养 6 2.7.10 痰标本的处理和保存 6 2.7.11 提取痰标本 DNA6 2.7.12LAMP 扩增及反应产物的检测 6 第 3 章 结果 8 3.1 病原体检测结果 8 3.2 LAMP 特异性结果8 3.3 LAMP 敏感度结果8 3.4 LAMP 反应结果9 IV 目录 第 4 章 讨论 11 第 5 章 结论 15 致 谢 16 参考文献 17 攻读学位期间的研究成果 19 综 述 20 V 第 1 章 引言 第1 章 引言 社区获得性肺炎(community acquired pneumonia, CAP)是在医院外由细菌、 病毒、衣原体和支原体等多种微生物所引起的，在美国, 由社区获得性肺炎住院 患者的病死率高达 13.6%,为感染性疾病死亡的首位原因[1] 。肺炎衣原体 （Chlamydia pneumonia, CP ）属于非典型致病菌，是社区获得性肺炎的一种常见 病原菌，多发生在年老体弱、免疫力低下者，而且容易反复发作，造成感染难 以控制，甚至可能并发重症肺炎，危及生命。据预测，2020 年我国将成为世界 第一老龄化大国，因此随着老年人占人口的比重日益增加，肺炎衣原体感染的 发病率及死亡率有逐渐增加的可能。现阶段临床上肺炎衣原体的诊断金标准仍 是血清学抗体检测，但该方法有一定的滞后性，不能早期明确诊断肺炎衣原体 感染。 聚合酶链式反应技术(polymerase chain reaction PCR) 是重要的核酸扩增技 术，在现代分子生物学的发展中起到非常重要的作用，它能够在 1--2 小时内将 靶基因迅速扩增几百万倍，目前已经广泛应用于医学领域的病原体的检测方面， 为临床疾病的诊断和治疗做出了较大贡献。但由于 PCR 技术需要反复改变反应 体温，其操作过程复杂，对反应仪器设备要求较高，限制了其作为快速诊断方 法的使用。2000 年日本学者 Notomi[2]等发明一种新的核酸扩增技术环介导等 温扩增法( loop-mediated isothermal amplification,LAMP)，其特点是等温条件下， 针对靶基因的 6 个区域设计 4 种特异性引物，在链置换 DNA 聚合酶完成核酸扩 增反应。其反应过程不需要模板 DNA 的高温变性，低温退火等过程，而且设备 要求简单，只需一个水浴锅，从而大大缩短了反应时间。总之，LAMP 是一种 崭新的 DNA 扩增方法，具有简便、快速、高特异性好等优点[[3][4]，该技术近年 来迅速发展，已广泛应用于病原菌的检测。 传统的血清学抗体检测虽然有一定的滞后