细粒棘球蚴中国大陆株亲肌肉抗原重组蛋白的表达、纯化及免疫学鉴定.pdfVIP

第3o卷 1期 宁夏医学院学报 2008年2月 Joumal of Ningxia Medical College 文章编号：1005—8486(2008)01—0001—03 · 论著· 细粒棘球蚴中国大陆株亲肌肉抗原重组蛋白的表达、 纯化及免疫学鉴定 马 锐 ， 师志云 ， 于晶晶 ， 王淑静 ， 王 洁 ， 张 焱 ， 高 岭 ， 赵 巍 (1．宁夏医学院基础学院遗传学和细胞生物学教研室，银川 750004；2．宁夏医学院中心实验室，银川 750~4) 摘要：目曲 对细粒棘球蚴中国大陆株亲肌肉基因(myophilin)的重组质粒进行原核表达、纯化，并初步鉴定重 组蛋白的免疫学特性，为重组疫苗研制的后续工作提供依据。方法 对已构建的基因工程菌株myophilin／ pGEM—T／JM109进行酶切，获取目的基因。将目的基因亚克隆于表达载体pE128a构建基因工程菌株，筛选阳 性表达菌株并进行诱导表达、经SDS—PAGE鉴定重组myophilin蛋白。以纯化的myophilin做抗原免疫小鼠，用 Western blot、ELISA对该蛋白的免疫原性及免疫鼠血清抗体水平进行检测。结果 成功构建含原核重组表达 载体myophilin／PET28a／B121，并纯化出浓度较高的重组蛋白；ELISA检测显示，用表达、纯化的重组蛋白免疫小 鼠，诱导产生了一定水平的血清抗体；实验组血清与对照组血清抗体含量差异有统计学意义(P0．05)。结 论 纯化后的重组蛋白myophilin具有较强的免疫原性，有望作为包虫病候选疫苗进一步研究。 关键词：细粒棘球蚴；亲肌肉抗原；基因克隆；表达；纯化；免疫鉴定 中图分类号：383．3+3 文献标识码：A 包虫病是由细粒棘球蚴虫所引起的一种严重危害人畜 收试剂盒购自北京赛百盛基因技术有限公司；200 bp DNA 健康的人兽共患寄生虫病，广泛流行于畜牧业发达的地区， marker、I~nbda DNA／HindⅢmarker、低分子质量marker、预染 是中国卫生部规划防治的五大寄生虫病之一。现已证实全 marker、HRP标记的羊抗鼠IgG购于北京华美生物工程公 国有31个省、市、自治区存在包虫病感染病例，有100多万 司；重组蛋白纯化试剂盒购自Novagen公司；弗氏完全和不 包虫病现症患者，受威胁人口达几千万…1。目前，对包虫病 完全佐剂、尿素、咪唑购自Sigma公司；其余试剂均为国产 的防治主要是通过手术治疗结合药物的化学治疗来进行， 分析纯。 相应的对包虫病的预防措施非常有限。随着分子生物学技 1．1．3 主要仪器 紫外分光光度仪(DMS200型)美国Vari 术的不断发展和广泛应用，推动了基因工程疫苗在预防各 an公司产品；凝胶成像仪和分析软件、蛋白质电泳及转印 种传染病和寄生虫病的应用研究。本研究在已克隆亲肌肉 装置、酶联免疫检测仪、洗板机均为BIO—RAD公司产品。 基因(myophilin)的基础上_2j，构建表达质粒，获取重组蛋 1．1．4 实验动物 6周龄健康雄性ICR小鼠，体重(18-4-2) 白，并对重组蛋白的免疫学特性进行鉴定，以期为细粒棘球 g，购自宁夏医学院实验动物中心。 蚴疫苗的研制及其诊断提供必要的实验依据。 1．2 方法 1 材料和方法 1．2．1 重组表达质粒 myophilin／pE328a／B121的构建及鉴 1．1 材料 定用BamH工、Not工同时对已构建的myophilin／pGEM—T／ 1．1．1质粒和菌种 myophilin／pGEM—T／JM109为本室构 JM109重组质粒和pE328a进行双酶切，将目的片段与表达 建。表达载体 pEr28a和大肠埃希菌(Escherichia coli) 载体pE328a在T4连接酶的作用下，4℃连接过夜。连接产 B121plys购自Novagen公司。 物转化入感受态细菌E．coliBI21，并在含有卡那霉素(终浓 1．1．2