北大医学部激光共焦显微镜与流式细胞总结.doc

激光扫描共焦显微镜与流式细胞总结 共焦部分 根据激光扫描共聚焦显微镜（Confocal）的工作原理，说明： 为什么Confocal能够逐层采集荧光样品的一系列高清晰光学切片？ Confocal 利用放置在光源后的照明针孔和放置在检测器前的探测针孔实现点照明和点探测，来自光源的光通过照明针孔发射出的光聚焦在样品焦平面的某个点上，该点所发射的荧光成像在探测针孔内，该点以外的任何发射光均被探测针孔阻挡。照明针孔与探测针孔对被照射点或被探测点来说是共轭的，因此被探测点即为共焦点，被探测点所在的平面即为共焦平面。计算机以像点的方式将被探测点显示在计算机屏幕上，为了产生一幅完整的图像，由光路中的扫描系统在样品焦平面上扫描，从而产生一幅完整的共焦图像。只要载物台沿着Z轴上下移动，将样品新的一个层面移动到共焦平面上，样品的新层面又成像在显示器上，随着Z轴的不断移动，就可得到样品不同层面连续的光切图像。 如何实现时间动态程序监测？ 将样品固定在同一个观察视野，利用动态时间程序软件，按照一定的时间间隔，自动采集某时间段内该视野的一系列图像，并定量测定相关参数的随着时间的变化。特点：快速跟踪毫秒级变化。具体操作如下： 在显微镜下找到活细胞； 调节扫描状态，获得满意图像； 把Mode改成XYT； 设定加药时间，加药后观察时间； 开始程序，自动完成程序。 如何利用Confocal实时监测细胞内钙离子变化？ （1）将细胞种在共焦小皿中， （2）将用FLuo3等银光染料标记好样本，在显微镜下找到合适的细胞。 （3）确定采集图像的条件，包括针孔的大小、光电倍增管的增益、滤片系统的选择、扫描速度和扫描密度等，扫描速度和扫描密度要精心选择，它直接影响采样频率，即会影响测量结果。 （4）根据细胞种类和所加的药物等实验要求，确定采集频率，即采集每一幅图像的间隔时间。当需要采样频率较高时，采集每一幅图像的时间间隔可设定为零，此时采样频率的快慢取决于扫描速度和扫描密度。如果仍然不能满足Ca2＋快速变化的要求，应加快扫描速度和减少扫描密度，或采用线扫描。然后根据扫描的总时程，确定共需采集多少幅图像。 （5）开始采集图像，加药前采集1分钟作为静息水平对照，加药后继续扫描。程序设定加药的等待时间。 （6）采集图像之后或采集之前，勾画感兴趣的细胞或细胞内某个区域（核周、胞浆、胞核或突起等），计算机会描绘出时间－荧光强度曲线。 影响所采集图像荧光强度的参数主要有哪些？ 物镜性能：放大倍数、数值孔径、分辨率、景深-焦点深度、镜像高度、物镜工作距离、视野范围； 激发光波长/强度； 发射波长范围/强度； 检测器灵敏度； Pinhole大小； 聚焦程度； 其他（可以不答）：甘油、盖片数等。 在Hoechst 33258、DAPI、PI（propidium iodide，碘化丙叮）、AO（acridine orange，吖啶橙）这四种核酸探针中 要特意地标记活细胞内的DNA，应该选择哪种核酸探针？ Hoechst 33258（定位于细胞核）、AO 若要特意地标记固定（死）的细胞内的DNA可选择哪种核酸探针？ DAPI（半通透细胞，定位于细胞核）、PI 显微镜部分 物镜的数值孔径及意义。 物镜的数值孔径：是物镜与样品之间介质的折射率(n)和1/2孔径角（u）的正弦值的乘积。 NA=n×Sin u 意义：数值孔径是物镜最重要的参数之一，它直接影响物镜的分辨率和物镜的镜像亮度。NA越大越好。 显微镜有几种性能指标？了解各种性能指标的意义。 数值孔径：物镜的最重要的参数之一，直接影响物镜的分辨率和物镜的镜像亮度。 分辨率：区分物平面两个点间最小距离为分辨距离即分辨率。它代表分辨微细结构的本领。 放大率：放大率等于物镜放大率乘以目镜放大率。 景深-焦点深度：景深表示清晰的像平面所能对应物平面前后空间的深度（或指焦点与样品上某点相一致时，能看清这一点及其上下两侧的结构）。那么，清晰部分的厚度即为景深，也称为焦点深度。 镜像亮度：显微图像亮度。 物镜工作距离：物镜工作距离越长，NA越小。 视野范围：镜下看到的目镜光阑所围的圆，其直径为视野宽度。 按校正像差分类，物镜有几种等级标识？每一种标识的意义. 消色差物镜：校正了球差，彗差和二种色光的位置色差。物镜外壳没有特殊标记。 平场消色差物镜：在消色误差镜的基础上还矫正了像散和场曲，像面平坦。物镜外壳标有PL或N PLAN字样。 半平场消色误差镜：清晰范围介于消色误差镜和平场消色误差镜之间，但明显优于消色误差经，接近平场消色误差镜。外壳刻有C PLAN. 平场半复消色误差镜：色差的校正程度介于平场消色误差镜与平场复消色误差镜之间。刻有PL　FLUOTAR,此类物镜通常作为观察荧光