大骨节病与骨性关节炎软骨细胞凋亡信号转导差异基因及补硒干预的对比研究中英文摘要.docVIP

论文中英文摘要 作者姓名：段琛 论文题目：大骨节病与骨性关节炎软骨细胞凋亡信号转导、差异基因及补硒干预的对比研究 中 文 摘 要 背景大骨节病（Kachin-Beck disease，KBD是一种以软骨坏死为主要改变的地方性变形性骨关节病，流行于我国从东北到西南的地带中，患病率和致残率很高。 自1849年俄罗斯Yurenski报道KBD以来其发病机制至今仍不清楚。目前KBD病因发病研究不限于流行病学、病理环境因素（低硒、T-2毒素等）等方面，基因和蛋白表达等。 骨性关节炎（Osteoarthritis, OA）是以关节软骨退变为主要特征，导致关节疼痛和功能障碍的疾病好发于膝、髋等负重关节，60岁以上老年人，与KBD好发于3-12岁儿童、发育障碍、增粗畸形等有显不同。这两类疾病均以关节软骨损伤为特征，严重影响成人劳动力和生活质量。近年来，随着对OA深入，证实软骨细胞凋亡、细胞因子信号转导障碍等是造成OA软骨损伤的重要原因。KBD的软骨损伤也涉及到凋亡细胞因子信号转导障碍进一步阐明。 目前，KBD病因发病机制中存在问题很多，急需解决的主要问题有：发病原因是单一因素还是环境-基因相互作用所致？KBD和OA关节软骨在有何不同？在基因水平KBD究竟发生了怎样的变化，其与OA有何区别和联系？硒预防和治疗KBD软骨细胞的机制是什么？为此，本论文主要对比研究KBD与OA软骨细胞凋亡信号转导、差异基因及补硒干预，以阐明这两类关节疾病在软骨细胞凋亡、基因表达、以及补硒对凋亡影响等方面的差异深入探讨KBD的病因、KBD与OA发病机制，KBD防治提供科学依据。 目的1. 通过体外培养KBD和OA关节软骨细胞，比较软骨细胞生长增殖、形态结构特性、细胞凋亡及其信号转导通路的异同； 2. 采用Agilent Human 1A基因表达谱芯片KBD和OA关节软骨表达基因，以筛选和确定KBD不同于OA的特征性基因； 3. 通过不同浓度补硒，体外干预软骨细胞，探讨硒对KBD、OA和正常软骨细胞生长和细胞凋亡的影响。 方法1. 将病例分为三组：KBD组，OA组和正常对照组。正常对照组和OA组选自非KBD病区，KBD组的病选自KBD病区，年龄49-65岁之间。根据国KBD病诊断标准，选择Ⅱ和病；根据WOMAC诊断OA病例，排除遗传骨病，风湿性等。软骨取材关节，方面达到匹配。 2. 在无菌条件下，体外培养KBD、OA和正常软骨细胞，运用MTT法、流式细胞仪、电镜、免疫荧光、激光共聚焦和免疫组化等实验方法，对比KBD、OA和正常软骨细胞生长特性和细胞凋亡途径不同；对三组软骨细胞进行补硒干预，比较不同浓度硒0.0125μg/ml～1.0μg /ml）对KBD和OA细胞生长和凋亡影响。 3. KBD和OA关节软骨细胞RNA，运用Agilent Human 1A基因表达谱芯片，间接标记方法，得荧光标记的cRNA靶物基因芯片杂交，Feature Extraction9.3、Spotfire 8.0和Genepix 3.0等软件，选择P＜0.05的具有明显表达差异的基因，以筛选KBD不同于OA的特征性基因。 结果1. KBD和OA凋亡和信号转导通路的对比研究1）KBD和OA组软骨细胞的增殖平均生长率显著滞后于正常对照组，其中KBD软骨细胞增率OA组。KBD软骨细胞超微结构细胞膜形态不规则细胞核扭曲变形细胞膜内糖原边集细胞膜糖原释放高尔基体和线粒体肿胀OA组细胞肿胀软骨细胞电子密度增加细胞膜绒毛减少胞浆大量游离脂滴高尔基体和内质网肿胀。 2）KBD和OA的软骨细胞凋亡显著高于正常组细胞增殖周期G/M期比例增高Fas、Bax、Caspase-3、Caspase-9表达上调；KBD软骨细胞aspase-8和P53表达低于OA而aspase-9表达高于OA。 3）KBD和OA具有相似的凋亡途径，OA相比，KBD更倾向于线粒体凋亡途径。 2. KBD和OA关节软骨基因及生物模型构建KBD与OA四组中基因233个，其中上调基因195个，下调基因38个根据其生物学功能分证实筛选出的基因中CSGALNACTPIM2 、EFNA1、SMAD-9、STK11、AQP、T-cell factor/LEF、PTN，APCDD1和CAV等对KBD具有重要意义主要涉及代谢、离子通道蛋白、凋亡等多方面基因，构建出氧化应激、氨基酸代谢、脂代谢等相关的通路模型。 3. 不同浓度硒干预对KBD和OA生长和凋亡的影响1）Se浓度＞0.05μg/ml正常软骨细胞生长Se浓度＜0.025μg/ml时仍对正常细胞的生长有；Se浓度＞0.μg/ml对有一定的毒性作用0.25-0.10μg/ml之间促进KB软骨细胞的生长，细胞保持增殖状态；OA软骨细胞，Se＞0.μg/ml对细胞增殖有毒性作用，Se＜0.25μg/ml硒也