环介导等温扩增联合横向流动试纸条可视化检测海豚链球菌方法的建立.pdfVIP

Online system: 农 业 生 物 技 术 学 报 Journal of Agricultural Biotechnology 2014, 22(12): 1584~1594 DOI: 10.3969/j.issn. 1674-7968.2014.12.014 环介导等温扩增联合横向流动试纸条可视化检测海豚链球菌方法的 建立 王瑞娜 周前进 陈炯* 宁波大学生物与海洋科学系，宁波315211 *通讯作者，jchen 1975@163.com 摘 要 海豚链球菌(Streptococcusiniae) 是一种革兰氏阳性球菌，呈β溶血，可感染多种淡水和海洋鱼 类。本研究利用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)进行核酸扩增，通过 横向流动试纸条方法(lateral flow dipstick, LFD)实现检测，建立了一种可应用于海豚链球菌快速检测的 LAMP-LFD 技术。该技术以海豚链球菌促旋酶B 亚单位(gyrase subunit B, gyrB)基因为检测靶标，设计3 对引物进行由生物素标记的LAMP 扩增反应，产物经异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)标 记的探针杂交后，在LFD 上完成检测。经优化的核酸扩增最适条件为65 ℃反应30 min ，在此条件下，阳 性扩增起始时间与模板浓度之间呈典型的线性相关性。从核酸扩增反应开始到LFD 显色，整个检测时 程只需40 min 左右，比常规PCR 技术缩短约2 h 。LAMP-LFD 能特异性地检出海豚链球菌，针对病原纯 1 培养物的检测灵敏度为8.70×10 cfu/mL，是LAMP 检测的10倍、常规PCR 检测的100倍。以灵敏度浓度 1 (8.70×10 cfu/mL) 的海豚链球菌基因组DNA 为模板进行的LAMP-LFD 结果显示该方法具有良好的重复 3 性。针对人工污染花鲈(Lateolabraxjaponicus)肝组织的检测灵敏度为4.35×10 cfu/mL，同样为常规PCR 检测方法的100倍。利用本方法可成功从患病花鲈的组织样品中检测出海豚链球菌，检测结果与常规的 细菌分离鉴定方法结果一致。因此，利用LAMP-LFD 能特异、准确、高效地检测出海豚链球菌，而且操作 简单、费用低、耗时短，有望成为海豚链球菌的常规检测方法。 关键词 海豚链球菌，环介导等温扩增技术(LAMP) ，横向流动试纸条(LFD) ，特异性，灵敏度 Visual Detection of Streptococcus iniae Based on Loop- mediated Isothermal Amplification Combined with a Lateral Flow Dipstick WANG Rui-Na ZHOU Qian-Jin CHEN Jiong* Department of Biology and Marine Science, Ningbo University, Ningbo 315211, China * Corresponding author, jchen 1975@163.com Abstract Streptococcusiniae is a species belonging to Gram-positive coccus and produces beta hemolysis, which can infect a broad range of freshwater and marine fish species and lead to seriously economic losses in the aquaculture industry worldwide. Thus, a di