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液相色谱的方法开发液相色谱的方法开发 液相色谱的方法开发液相色谱的方法开发 一 分离方法 第一步干什么第一步干什么?? 第一步干什么第一步干什么?? ❀ 想办法得到各种信息 ✎ 向同行了解是否做过此类样品 或有否类似 样品的分析方法 ✎ 查文献 如CA(化学文摘) ✎仪器制造商的文献 如Waters ❀ 对色谱柱有足够的了解 ✎ 掌握分离机理 自己开发方法 ❀ 充分了解您自己的样品 分析时要了解哪方面的情况分析时要了解哪方面的情况 分析时要了解哪方面的情况分析时要了解哪方面的情况 ❀ 灵敏度的要求有多高? ❀ 样品的本底是否很复杂? ❀ 有多少组份要分析? ❀ 对分析的精确度 准确度等有多高要求? ❀ 是否因是日常检验 而要求方法容易使用? 分离时要了解哪方面的情况分离时要了解哪方面的情况 分离时要了解哪方面的情况分离时要了解哪方面的情况 ❀ 要分离 即制备 的样品量有多大? ❀ 要分离的组份在样品中的含量很高? 还是 微量? ❀ 是否需要保持生物活性? ❀ 对分离产物纯度的要求有多高? ❀ 纯度或活性的鉴定如何完成? 一般的具体步骤一般的具体步骤 一般的具体步骤一般的具体步骤 ❀ 先用一根短的色谱柱 ❀ 用相对较高的流速 ❀ 使用尽可能纯度高的标准品 ❀ 先用高强度的洗脱液 请记住请记住 请记住请记住 ❀ 调节k’ 值改变保留值 每次改变一个参数每次改变一个参数 每次改变一个参数每次改变一个参数 ❀ 调节α值改变选择性 ❀ 调节柱长度改变柱效及分离速度 使用文献方法使用文献方法 使用文献方法使用文献方法 ❀ 色谱柱填料的种类 品牌是否相同? ❀ 注意文献方法的流动相 ✎ 是否损害色谱柱? ✎如色谱填料品牌不同 需要调整流动相 ❀ 注意色谱柱的规格 内径 柱长 ✎ 需要调整流速 进样量 ❀ 注意梯度条件 ❀ 了解系统的滞后体积 梯度 色谱方法转换色谱方法转换 色谱方法转换色谱方法转换 ❀ 如果没有与文献或要求相近的色谱柱 ✎转换进样量 (D现在 )2 L现在 进样量(Load ) = Load 初始 × 2 (D初始 ) L初始 D = 内径 L = 长度 ✎转换流速