下一代DNA测序仪的原理和展望论文.doc

下一代DNA测序仪的原理和展望 摘要：DNA测序技术已广泛应用于生物学研究的各个领域，很多生物学问题都可以借助高通量DNA测序技术予以解决第一代测序技术是双脱氧链末端终止法——根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生A，T，C，G四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得DNA序列.第二代测序技术是焦磷酸测序法——由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，适于对已知的短序列的测序分析.而第三代测序技术则是基于纳米孔的单分子读取技术，这种方法读取数据更快、有望大大降低测序成本，改变个人医疗的前景.而第三代测序技术则是基于纳米孔的单分子读取技术，这种方法读取数据更快、有望大大降低测序成本，改变个人医疗的前景虽然目前已知第三代测序技术的基本原理是在纳米孔中配置纳米电极，用电测方法测量一个DNA的核酸碱基排列美国宣称要在2012年推出成熟的第三代基因测序仪. 1 下一代DNA测序仪原理 DNA测序略，可以分为几类例如美国RocheAppliedScience公司的454基因组测序仪、美国Illumina公司和英国Solexatechnology公司合作开发的Illumina测序仪、美国AppliedBiosystems公司的SOLiD测序仪、Dover/Harvard公司的Polonator测序仪以及美国Helicos公司的HeliScope单分子测序仪.Hillier对线虫CB4858品系进行Solexa重测序, 寻找线虫基因组中的SNP位点和单位点的缺失或扩增. 但是也应该看到, 由于这种高通量测序读取长度的限制,使其在对未知基因组进行从头测序的应用受到限制,这部分工作仍然需要传统测序(读取长度达到850 碱基)的协助.但是这并不影响下一代测序技术在全基因组mRNA表达谱, microRNA表达谱, ChIP-chip以及DNA甲基化等方面的应用.2008 年Mortazavi等人对小鼠的大脑、肝脏和骨骼肌进行了RNA深度测序, 这项工作展示了深度测序在转录组研究上的两大进展,表达计数和序列分析. 对测得的每条序列进行计数获得每个特定转录本的表达量,是一种数码化的表达谱检测, 能检测到丰度非常低的转录本.分析测得的序列, 有大于90%的数据显示落在已知的外显子中,而那些在已知序列之外的信息通过数据分析展示的是从未被报道过的RNA剪切形式, 3′末端非翻译区,变动的启动子区域以及潜在的小RNA前体,发现至少有 3500 个基因拥有不止一种剪切形式.而这些信息无论使用芯片技术还是SAGE文库测序都是无法被发现的.同年Sugarbaker利用mRNA深度测序对恶性胸膜瘤和对照样品进行比较,发现了肿瘤中存在的 15 个不同的点突变，高通量测序另一个被广泛应用的领域是小分子RNA或非编码RNA(ncRNA)研究. 测序方法能轻易的解决芯片技术在检测小分子时遇到的技术难题(短序列, 高度同源), 而且小分子RNA的短序列正好配合了高通量测序的长度, 使得数据“不浪费”, 同时测序方法还能在实验中发现新的小分子RNA.在衣藻、斑马鱼、果蝇、线虫、人和黑猩猩中都已经成功地找到了新的小分子RNA.在线虫中获得了 40 万个序列,通过分析发现了 18 个新的小RNA分子和一类全新的小分子RNA ,通过对人胚胎干细胞发育前后的分析,获得了334个小RNA的表达谱带,包括新发现的 104个小RNA 在DNA-蛋白质相互作用的研究上,染色质免疫沉淀-深度测序(ChIP-seq)实验也展示了其非常大的潜力.染色质免疫沉淀以后的DNA直接进行测序,对比ref seq可以直接获得蛋白与DNA结合的位点信息相比ChIP-chip,ChIP-seq可以检测更小的结合区段、未知的结合位点、结合位点内的突变情况和蛋白亲合力较低的区段. 2007 年Johnson等人用ChIP-seq 对转录因子NRSF在DNA上的结合位点进行了全基因组的筛查,获得1946 个结合位点,最小能分辨的结合位点为 50个碱基,这些高质量的ChIP-seq结果提供了研究新的DNA-蛋白相互作用的内容,其中包括了胰岛发育调控网络中的重要转录因子. 同年Robertson等人用同样的方法检测转录因子和基因组DNA的结合情况.这两项研究同时验证了以往用ChIP-chip实验检测到的结合位点,同时发现新的结合位点, Robertson等人发现, ChIP-seq的分辨率可达40碱基.2008年Chen等人在Cell上发表论文,用ChIP-seq检测了Nanog, Oct4, STAT3,Smad1, Sox2 等13 个序列特异性的转录因子与基因组DNA的结合情况,这