基因的分离技术.ppt

基因的分离技术;DNA主要存在于细胞核的染色体中。 核外也有少量DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA（cpDNA）， 质粒DNA。 总的原则: 保证一级结构的完整性; 排除其它分子的污染;;(1) 破碎细胞，裂解细胞壁 机械方法: 超声波处理、研磨、 匀浆 化学方法: SDS（阴离子去垢剂） EDTA，使得DNase失活 酶学方法: 溶菌酶或蜗牛酶 (2) 通过蛋白质变性或分解，使 DNA游离出来 (3) 分离DNA;2. cDNA的分离与纯化 ;逆转录过程中cDNA的合成; RNase，不需辅助因子，耐酸碱，分布极广 RNase的来源 外源：操作者，实验器皿，试剂，空气 内源：不同组织和细胞数量不同 创造无RNase的环境 —DEPC(焦碳酸二乙酯)（配成0.1%的DEPC 水） —异硫氰酸胍 Trizol试剂;获得高纯度RNA 在一小时之内分离RNA在3小时内分离DNA或蛋白质 在4摄氏度条件下稳定保存两年以上 ; Trizol的主要成分是苯酚。 苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8-羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。 　　;　　※0.1%的8-羟基喹啉可以抑制 RNase，与氯仿联合使用可增强抑制作用。 　　※异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。 　　※β-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。 ;Trizol法提取总RNA的实验原理： Trizol试剂裂解细胞并释放出RNA,酸性条件使RNA与DNA分离,加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。 RNA存在于( 水样层 )中。收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。 在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。;3. 质粒DNA的分离与纯化;质粒DNA的提取——碱裂解法的原理; 4. 基因文库的应用; 基因文库的构建;基因组DNA???库，Genomic libraries : 含有某种生物体全部基因的随机片段的重组DNA克隆群体； cDNA文库，cDNA libraries：是指含有所有重组cDNA的克隆群体。 ;2. 目的基因的获取;谢谢观赏啦;SDS