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实时荧光定量ＰＣＲ技术原理简介The principle of Real-time Quantitative PCR Content 1 Primary Principle 2 Quantitative Principle 3 Fluorescent Chemical Principle 4 Comparison with traditional PCR method 一、 基本原理 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。 二、 定量原理 定量PCR—以参照物为标准，对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测，从而达到评估样本中靶基因的拷贝数。定量PCR的可行性定量一般是在PCR扩增的指数期进行的。 Ct值—指每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。 阈值（threshold）—指PCR反应的前15个循环的荧光信号，荧光阈值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。 二、定量原理 Ct值与起始模板—每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 二、定量原理 用模板初始量（或未知量样品的稀释倍数）的log 值对每个稀释样品的Ct 值作图，两者呈递减的线性关系，称之为标准曲线。 三、化学原理 监测目标序列扩增的化学方法荧光化学： DNA 结合染料（SYBR Green I） 荧光染料标记地序列特异性寡聚核苷酸引物或探针（ TaqMan探针、分子信标等） SYBR Green I SYBR Green I 是荧光定量PCR 最常用的DNA 结合染料，与dsDNA非特异性结合。在游离状态下，SYBR Green I 发出微弱的荧光，但一旦与dsDNA 结合，其荧光增加1,000 倍（图）。 一个反应发出的全部荧光信号与出现dsDNA 量成比例，且会随扩增产物的增加而增加。 TaqMan 探针 TaqMan探针是一条序列特异地、荧光标记的寡聚核苷酸探针，包含5’端的荧光报告基团（reporter）和3‘端的荧光淬灭基团（quencher）。 探针完整时，由于荧光报告基团接近淬灭基团，报告基团的荧光被淬灭，在扩增反应退火/延伸合并的阶段，探针与靶标杂交，Taq 酶5’—3’端的外切酶活性切除报告基团，报告基团与淬灭基团分离产生荧光信号，并与样本中扩增产物的量成比例。（图 ） 分子信标 分子信标是一段荧光标记、具有茎环状发夹结构的寡聚核苷酸，5’端附有荧光报告基团，3’端附有淬灭基团，环被设计成与靶标序列的15–30 核苷酸特异杂交，环的两端各有5-6 核苷酸互补形成茎结构，将两个基团连接到一起。 发夹结构中，报告基团接近淬灭基团，监测不到荧光信号，退火阶段分子信标与靶标序列结合，两基团分离，报告基团不再被淬灭。 与TaqMan 实验不同，在反应中分子信标被替代而不是被破坏。由分子信标上报告基团发出的荧光信号强度与反应中靶标的量成比例。（图） 四、与传统PCR的比较 可以用于定性（判断一段序列的有无），也可以用于定量（确定DNA 拷贝数），而常规PCR 只能做半定量。 荧光定量PCR 的结果无需通过琼脂糖凝胶电泳来评估，大大节省实验时间，提高实验效率。 由于PCR 反应和检测都在反应管中进行，样品污染的几率大大降低，无需扩增后的实验操作。 * SYBR Green I Experiment of TaqMan *