磷脂酰肌醇-中国显微图像网.PDF

·734· 生物化学与生物物理进展 !#$% ’()*+,% ’(-*./% !#$ 01 %’ 磷脂酰肌醇- 酶不直接调控 2激 3451 细胞的分泌6 ** ** *** 刘媛媛 赵 平 吴政星 瞿安连 徐 涛 (华中科技大学生命科学与技术学院生物物理与生物化学研究所，武汉 430074) 摘要 磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)是磷脂酰肌醇代谢过程中一种重要的酶，通过其代谢产物参与了对多种细胞生理 活动的调节，如囊泡运输、细胞骨架重组、细胞存活、吞噬作用、细胞凋亡等.为研究其对细胞分泌功能的作用， 使用磷脂酰肌醇 -3激酶家族的特异性抑制剂渥曼青霉素(wortmannin)阻断磷脂酰肌醇-3激酶的活性，以 EGFP-2xFYVE融合蛋白与磷脂酰肌醇-3-磷酸(PtdIns-3-P)的结合为指征，使用荧光显微成像技术检测渥曼青霉素 对磷脂酰肌醇-3激酶的抑制作用，采用膜片钳膜电容测量方法及光解钙离子释放技术检测渥曼青霉素对PC12细 胞分泌功能的影响.实验结果表明，wortmannin阻断了磷脂酰肌醇-3激酶的活性，抑制了磷脂酰肌醇-3-磷酸 (PtdIns-3-P)的产生，并使FYVE与PtdIns-3-P解离，但渥曼青霉素处理之前和处理30min后的PC12细胞分泌反 应的幅度、动力学特性和分泌的钙依赖性均无显著差异，表明磷脂酰肌醇-3激酶对PC12细胞的分泌无显著的直 接影响. 关键词 磷酸酰肌醇-3激酶，渥曼青霉素，PC12细胞，分泌动力学，钙依赖性，钙离子光解释放技术， EGFP-2xFYVE融合蛋白 学科分类号 Q27 神经元和内分泌细胞主要通过严格调控的囊泡 常低的浓度(100 nmol/L)即能完全抑制磷脂酰肌醇 胞吐完成神经递质和激素的释放[1] -3激酶的作用[4] 。在囊泡与细胞 .磷脂酰肌醇-3激酶能使磷脂酰肌 质膜融合以前，必须经历一系列成熟(maturation)过 醇(phospoinositide,的第三位羟基磷酸化，PtdIns) 程，包括囊泡的募集(recruitment)、拴系(tethering)、 从而生成一系列脂类信号分子如磷脂酰肌醇-3-磷 [2] 锚定(docking)和激活(priming)等 .当受到分泌信号 酸(PtdIns-3-P)、磷脂酰肌醇-3,4-二磷酸 的触发后，囊泡膜与细胞膜融合，其内含物通过融 )和磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸 )等. 4-P 2 3 合孔释放至细胞外.其后，通过细胞的胞吞活动， 磷脂酰肌醇多磷酸 (如 PtdIns-3,4-P、 2 囊泡被内吞并加以重新利用，整个过程为囊泡的循 5-P)代谢产物分子在体外呈钙离子浓度依赖性地与 3 [5] 环.尽管对囊泡胞吐的分子机制和调控过程已有较 囊泡分泌的钙感受器分子 synaptotagmin结合 ， 引导和加速synaptotagmin与细胞膜结 广泛和深入的研究，但仍有许多重要细节和调节过 PtdIns-3,4-P