位点特异整合型微环dna的构建及应用-中国医药生物技术.pdfVIP

中国医药生物技术 2014 年 2 月第 9 卷第 1 期 Chin Med Biotechnol, February 2014, Vol. 9, No. 1 13 DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.01.004 ·论著· 位点特异整合型微环 DNA 的构建及应用 刘浏，周在威，马晴雯 【摘要】 1 材料与方法 目的 联合应用 LR 克隆酶和链霉菌噬菌体 ΦC31 整合 1.1 材料 酶系统，建立一种获得位点特异整合型微环 DNA 的方法， 1.1.1 细胞与质粒 人宫颈癌细胞系 HeLa 细胞 为该载体在转基因研究中的应用提供科学资料。 购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中 方法 应用分子克隆技术，在目的基因表达盒及链霉菌 心；质粒 pEGFP-N1-attB[10]和 pcDNA3.1(-)-P1A3- attB 位点两端接入 λattR 和 λattL 片段，随后插入 ΦC31 TPO[11] 由本所构建保存；表达噬菌体 ΦC31 整合酶 整合酶基因表达盒，构建可获得微环 DNA 的亲本质粒。 的质粒 pPGKPhiC31obpA[12] 购于美国 Addgene 该亲本质粒上的 λattL 和 λattR 序列可在 LR 克隆酶的催 公司（Plasmid No. 13795 ）；大肠杆菌 E. coli TOP10 化下重组生成表达 ΦC31 整合酶的微质粒和含有目的基因 感受态细胞购自天根生化科技（北京）有限公司。 表达盒及 attB 位点的微环 DNA 。以限制性内切酶酶切、 1.1.2 主要试剂 LR 克隆酶、DMEM 培养液、 定性以及定量 PCR 分析其重组效率。并将未经纯化的 LR 血清及 PBS 均购自美国 Life Technologies 公司， 重组体系转染 HeLa 细胞，以流式细胞技术、克隆计数、 引物及 λattL 和 λattR 也由该公司合成；GenJet™ ELISA 等方法检测其转染率、整合率及目的蛋白表达水平， Plus 转染试剂购自美国 SignaGen 公司；限制性内 并与传统质粒进行比较。 切酶和 T4 DNA 连接酶购自美国 NEB 公司； ® 结果 LR 克隆酶可有效催化亲本质粒的重组，重组率达 SYBR 荧光定量 PCR 试剂购自日本 Takara 公 80% 以上。重组体系中的微环 DNA 和微质粒无需纯化即 司；hTPO ELISA 试剂盒购自美国 R D 公司； 可成功转染 HeLa 细胞，且其转染率、整合率以及目的蛋 PCR 纯化试剂盒和胶回收试剂盒购自德国 Qiagen 白表达水平均高于传统质粒。 公司。 1.2 方法 结论 建立了一种高效、快速获得位点特异整合型微环 1.2.1 目的片段的获得 将合成的 λattL 和 λattLrc DNA 的方法。 单链（分别含有限制性内切酶 Afl III 和 Ase I 黏 【关键词】微环 DNA ； LR 克隆酶； ΦC31 整合酶； 性末端，序列见表 1 ）干粉配制为 100 μmol/L 的 位点特异性整合 溶液后等物质的量混合，置于 100 ℃ 沸水中待其 中国医药生物技术, 2014,