基因操作的基本技术ⅱ－pcr技术-生物学试验教学中心.docVIP

第四章 PCR技术 PCR（polymease chain reaction）技术是20世纪80年代中期发展起来的一种DNA体外扩增新技术，它是现代分子生物学和分子遗传学研究的重要方法。它是将提取的总DNA (或cDNA)变性后使之成为单链，变性后的DNA将作为DNA聚合酶链式反应的模板。首先设计并合成与待扩增的双链DNA片段两条链的3’端互补的寡聚核苷酸引物(一般每个引物多于15个核苷酸)，然后在50～60℃的温度下将过量的引物加入到少量的DNA样品，这时DNA保持单链状态，而合成的特异性引物能够与其互补序列配对复性，这些杂交上的寡聚核苷酸将作为引物，参与模板DNA互补链的合成。加入dNTP和耐热的Taq DNA聚合酶后，DNA合成反应开始，Taq DNA聚合酶能在高达72℃的条件下进行反应。当反应完成时，将反应混合物加热到95℃使新合成的DNA双链变性，当温度下降以后，由于过量引物的存在，另一轮的反应又可以进行。这种合成—变性—退火—合成的循环可以重复多次，使所需要的DNA片段得到特异性的扩增，在理想的条件下，每一次循环使两个引物位点之间的DNA序列增加一倍。 这项技术从开始诞生到现在，不断发展和简化，现已完全实现了自动化。目前已生产出各种型号的PCR仪，由于引物的长短和碱基的组成不同，所需的复性温度和时间存在差异。现已衍生了许多相关的方法，如RAPD(random amplified polymorphic DNA)，AP-PCR (arbibary primed－PCR)，DAF (DNA amplification fingerprint)，AFLP (amplified fragment polymorphism)等。 实验一 PCR技术与分析 一、原理和用途 PCR扩增是一种特定区段DNA的复制，这仍然遵守DNA生物合成的基本规律，其复制方式是以半保留形式进行的。PCR法扩增DNA，必须有DNA模板、DNA聚合酶、DNA引物和四种dNTPs。特异性DNA片段的扩增需要2个寡核苷酸序列互不相同的引物，它们与模板DNA两条链上各一段序列互补，一个是上游引物，一个是下游引物，扩增的片段长度正好是两个引物之间的长度加上两个引物的长度。引物1和引物2这段DNA的序列是已知的，这是PCR扩增的必要条件，而它们之间的序列未必清楚。引物1和引物2序列的长度一般为15～30个碱基，可以用DNA合成仪合成二个引物。PCR扩增系统中模板DNA经过高温变性后，分解为二条单链。然后，系统温度降低到退火温度（38～65℃），引物与其互补的模板DNA结合，形成局部双链，这是DNA复制的固定起点，即延伸的固定起点。 PCR扩增过程中，链的延伸是有方向性的。以引物为固定起点，延伸才能进行。目前使用的DNA聚合酶，合成DNA的方向都是从5端到3端。当PCR扩增系统温度升至60～72℃时，已经与引物退火的单链，由固定的延伸起点在聚合酶的作用下4种dNTPs会迅速地以旧链为模板，合成新链。若以Ａ和B引物而言，合成的方向都是从5端到3端的方向进行。PCR扩增片段的长度正好是两个引物之间的长度加上两个引物的长度。其范围从数百个至数千个碱基，使用长片段扩增的Taq 聚合酶，可达20 kb以上。 利用PCR技术能够从复杂的DNA分子群体中选择性地复制一段特异的序列，使某一DNA片段得到特异性的扩增。其基本原理就是仿照生物体内DNA变性一复性一DNA链延长的周期循环过程（见前述）。模板DNA经过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段的循环过程。前一轮扩增产物又是下一轮扩增的模板，每循环一次，模板DNA的拷贝数加倍。第一次循环，由一条模板双链DNA变成二条；第二次循环，则变成４条；第三次循环，就变成８条；以几何级数扩增下去。循环n次，理论上可得到2n个分子。一般的扩增循环是30～35次，最后形成特定的DNA片段。PCR扩增DNA特定区段，是由人工合成的二条寡核苷酸引物决定的，引物是PCR扩增的关键。 目前PCR技术已用于生物科学的许多领域，已在基因扩增、基因的克隆、DNA分子多样性分析、疾病诊断、突变检测、基因表达分析等方面得到了广泛的应用。 对于PCR技术，由于所用的DNA量很少，因此除了分离的DNA可用于PCR外，还有其它的DNA微量分离法，甚至微量细胞用开水煮一下都可以用于PCR。为了加入PCR精确的DNA量，同样必须测定DNA的浓度，再根据其浓度计算出所需DNA量的体积。 二、实验材料 DNA样品溶液。 三、溶液与缓冲液 Taq DNA聚合酶 dNTP 10×PCR缓冲液 上游引物，下游引物 25 mmol/L MgCl2 10×TBE 缓冲液： 900 mmol/L Tris 900 mmol/L 硼酸 100 mmol/L EDTA pH 调至8.0