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固定化技术在壳聚糖酶生产中应用 　　摘要：以产酶活性与产酶稳定性为指标评价3种固定化细胞产壳聚糖酶（Chitosanase， EC3.2.1.99）方法，以酶比活力、酶结合效率、酶活力回收率及稳定性评价4种固定化壳聚糖酶方法，以筛选最优固定化方案应用于壳聚糖酶的生产。结果表明，海藻酸钠壳聚糖包埋法固定化细胞的产壳聚糖酶活性较高且稳定性好；海藻酸钠壳聚糖吸附包埋固定化壳聚糖酶的酶比活力、酶结合效率与酶活力回收率均为最高，且稳定性强。 关键词：固定化技术；壳聚糖；壳聚糖酶（Chitosanase， EC3.2.1.99）；海藻酸钠 中图分类号：Q556+.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）21-5282-03 Application of Immobilization Technique in Producing Chitosanase YUAN Jian-ping，HOU Xiao-qiang （College of Life Science， Langfang Normal University， Langfang 065000，Hebei， China） Abstract： Chitosanase production was optimized through evaluating three methods of cells immobilization using the activity and stability of enzyme production as indicators. Four methods of enzyme immobilization were evaluated using of the enzyme combination efficiency， enzyme activity recovery and enzyme stability as indicators. The results showed that the sodium alginate and chitosan embed method was the optimal method of cells and enzyme immobilization due to its best performance in the activity and stability of enzyme production and in the enzyme activity， enzyme combination efficiency， enzyme activity recovery and enzyme stability. Key words： immobilization technique； chitosan； chitosanase（EC3.2.1.99）； sodium alginate 壳聚糖酶（Chitosanase，EC3.2.1.99）是一种高效、专一水解壳聚糖制备壳寡糖的酶[1，2]。近年来，利用专一性壳聚糖酶水解壳聚糖制取壳寡糖已成为甲壳素工业的研究热点与前沿[3，4]。目前壳聚糖酶研究多集中于菌种筛选与游离细胞产酶条件等方面。固定化细胞与固定化酶技术对于提高酶的生产与应用效率有重要意义[5，6]。本试验采用多种方法对产壳聚糖酶菌种及壳聚糖酶固定化进行研究，旨在筛选最适固定化细胞及固定化酶的方法。 1 材料与方法 1.1 药品与试剂 壳聚糖 （脱乙酰度≥80%，济南海得贝海洋生物工程公司），海藻酸钠（黏度范围：1.05～1.15，天津市永大化学试剂开发中心），乙酸、NaOH、甲醇、戊二醛、HCl、NaCl、CaCl2等试剂均为国产分析纯。 1.2 菌种与培养基 产壳聚糖酶菌株Yg，廊坊师范学院生命科学学院微生物实验室保存提供。改良PDA培养基：马铃薯（去皮）200 g，葡萄糖30 g，蛋白胨2 g，KH2PO4 0.5 g，（NH4）2SO4 0.5 g，维生素B1 10 mg，蒸馏水1 000 mL，115 ℃高压灭菌30 min[7]。产酶培养基：KCl 5 g，NaCl 5 g，MgSO4·7H2O 5 g，K2HPO4 0.75 g，FeSO4 0.01 g， 蛋白胨8.5 g， 牛肉膏0.25 g，壳聚糖 10 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.5～8.0，121 ℃高压灭菌30 min[8]。 1.3 方法 1.3.1 固定化细胞产壳聚糖酶 将Yg菌株于改良PDA斜面上活化2次，而后接种于改良PDA液体培养基，36 ℃、180 r/min培养16 h，再用0.75%无菌生理盐水5