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大鼠心肌缺血再灌注后结蛋白变化 　　【摘要】 目的：探讨缺血再灌注损伤后大鼠心肌细胞内结蛋白分布状况与含量的变化。方法：30只成年健康雄性SD大鼠，随机分为缺血组、缺血再灌注组及假手术组。缺血组实施手术结扎冠状动脉30 min后即刻取材，再灌注组缺血后再灌注120 min后取材，假手术组实施同样的手术过程但不结扎。应用免疫荧光标记技术和图像定量分析方法对大鼠心肌细胞结蛋白分布及含量的变化进行研究。结果：缺血组和缺血再灌注组心肌结蛋白在心肌细胞内的分布较假手术组的有序分布发生改变，变得无序而紊乱，心肌纤维横纹不再清晰，变得断续而模糊。缺血组和缺血再灌注组心肌结蛋白含量显著低于对照组（P0.05），具有可比性。 　　1.2 实验方法 1.2.1 大鼠心肌缺血再灌注模型的建立 缺血再灌注组大鼠腹腔注射10%水合氯醛（1 ml/100 g体重）麻醉，利用气管插管接鼠类动物呼吸机进行人工呼吸（潮气量20 ml/kg，频率60～80次/min），心电监护仪监测其心电变化。开胸后于左冠状动脉前降支起始2～3 mm处用4.0手术缝合线穿过动脉深面备用，用一细小柔软胶片垫于血管与结扎线之间，待呼吸、血压平稳15 min后结扎，30 min后剪除结扎线再灌注120 min后处死大鼠。结扎成功参照标准：结扎点远端动脉分布区域心肌颜色发绀，心电图QRS波群增高增宽，ST段抬高。再灌注成功参照标准：缺血部位心肌颜色恢复至正常水平，抬高的ST段至少下降50%。缺血组结扎30 min后即刻处死取材。假手术组手术过程参照实验组，差别是在穿线后不结扎，30 min后取下缝合线，关闭胸腔，120 min后处死大鼠。 1.2.2 大鼠心肌取材切片 处死大鼠后迅速取出心脏，生理盐水清洗后迅速于梗死区域（假手术组在相同区域）切取心肌组织，置于冰冻切片机专用标本盘，滴加OCT包埋剂后连同标本盘迅速置于液氮内冷冻20 s后转入冰冻切片机切片箱，切取7 μm厚的冰冻切片置于-70 ℃超低温冰箱备用。 1.2.3 心肌冰冻切片的免疫荧光染色 结蛋白于心肌细胞内及闰盘处表达，选用FITC荧光标记，具体步骤如下：（1）将冰箱保存的冰冻切片取出，室温复温30 min后用4 ℃丙酮液固定10 min，用PBS缓冲液漂洗3次，5 min/次；（2）滴加10%正常山羊血清封闭，室温下孵育10 min；（3）倾去血清后勿洗，滴加经PBS 1：100稀释的小鼠抗大鼠结蛋白抗体，4 ℃过夜，用PBS缓冲液漂洗3次，5 min/次；（4）滴加经PBS 1：100稀释的FITC标记兔抗小鼠IgG，37 ℃下孵育1 min，用PBS缓冲液漂洗3次，5 min/次；（5）滴加60%的缓冲甘油封片。 1.2.4 免疫荧光图像的采集和分析 使用Leica AS MDW激光共聚焦成像工作站采集结蛋白的免疫荧光标记图像，所有图像均采用同一曝光时间及相同的条件采集。每张切片于缺血区域随机选取心肌纵切视野5个，将数字图像储存以待分析。应用JD801图像分析系统对数字图像进行定量分析，测定结蛋白阳性表达部位的积分灰度值，以积分灰度值的大小代表结蛋白表达量的多少，对缺血再灌注损伤后心肌结蛋白进行定量分析。 1.3 统计学处理 图片定量分析采用SPSS 19.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，组间进行单因素方差分析，以P 　　实验结果显示，缺血组和缺血再灌组心肌结蛋白的分布状况发生了很大的变化，可见在不同心肌细胞或者同一心肌细胞的不同部位结蛋白分布不再均一，呈现局部或增多或减少甚至缺失，心肌纤维横纹亦变得模糊不清。两组心肌结蛋白含量显著下降，缺血再灌注组心肌结蛋白含量下降更为明显，这说明缺血后心肌结蛋白发生了一定程度的降解，而缺血后的再灌注则加重了心肌的损伤促进了结蛋白的降解。心肌的缺血再灌注损伤可造成心肌结蛋白的大量降解，致使细胞骨架结构遭到严重破坏，从而导致心肌机械功能的暂时障碍，即心肌顿抑。缺血再灌注后心肌结蛋白的降解造成心肌细胞骨架三维结构的破坏，而细胞骨架通过锚定诸如线粒体、细胞核、肌丝、高尔基体等亚细胞结构来维持细胞的稳定性，细胞骨架结构的破坏可能使细胞膜以及其他细胞器对各种损伤因子的敏感性增强，使细胞更易受到这些损伤因子的攻击而损伤；也就是说结蛋白的降解既是心肌缺血再灌注损伤的一个结果，又是心肌损伤进一步发展进而导致心肌机械功能障碍的因素。 心肌缺血再灌注损伤可造成心肌结蛋白的降解，从而改变结蛋白在心肌细胞的分布状况，即原有的均匀分布的模式转变为部分心肌结蛋白减少或缺失，心肌纤维横纹变得模糊不清。结蛋白的降解导致心肌细胞骨架结构遭到破坏。心肌缺血再灌注后心肌结蛋白的上述改变可能是导致的心肌机械功能异常的解剖学基础。 参考文献 [1